本發(fā)明涉及生物技術(shù)和細(xì)胞治療領(lǐng)域，具體為一種重組構(gòu)建體、car修飾的細(xì)胞及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、car-nk療法和car-t療法都屬于細(xì)胞免疫治療技術(shù)。目前，car-nk細(xì)胞療法已在胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種實(shí)體瘤的早期臨床或臨床前試驗(yàn)中展現(xiàn)出一定效果，這使得car-nk療法有望填補(bǔ)car-t療法在治療實(shí)體瘤方面的缺憾。加之其“現(xiàn)貨型”的屬性，可以大大縮短治療時(shí)間及成本。

2、實(shí)際car-nk細(xì)胞構(gòu)建和改造中，針對(duì)不同的抗原設(shè)計(jì)和改造胞外靶標(biāo)識(shí)別區(qū)(又稱為抗原結(jié)合區(qū)或抗原識(shí)別區(qū))，基于細(xì)胞表達(dá)的復(fù)雜性，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致嵌合抗原受體(簡(jiǎn)稱car)不表達(dá)，所以如何針對(duì)不同的抗原構(gòu)建有針對(duì)性的car-nk細(xì)胞或car-t細(xì)胞，并且還能同時(shí)表達(dá)某些細(xì)胞因子，是目前行業(yè)研究的熱點(diǎn)和痛點(diǎn)。每一款成功構(gòu)建的針對(duì)不同抗原的car-nk細(xì)胞或car-t細(xì)胞，針對(duì)人類進(jìn)一步攻克和治療多種實(shí)體瘤方面，都具有巨大的價(jià)值和重要貢獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種car修飾的免疫細(xì)胞、制備方法及應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種重組構(gòu)建體，同時(shí)編碼il-10、il-15和car，其片段或變體，所述car的抗原包括：cldn18.2、cd19，cd5、cd20、cd22、cd23、cd30、cd33、cd34、cd37、cd38、cd43、cd72a、cd78、cd79a、cd79b、cd86、cd134、cd137、cd138、cd319、gpc3、cd32b、cd171、cs-1、cll-1、bcma、gd2、gd3、psma、ror1、flt3、fap、cd44v6、cea、epcam、b7h3、il-13ra2、mesothelin、her2、muc1、egfr、cldn6、dll3、nyeso-1、wt1、nectin-4、gpc3、pdl1以及nkg2dl的任意一種或組合。

4、優(yōu)選地，所述car的抗原為cd19，所述重組構(gòu)建體的核酸序列如seq?id?no.7所示、其片段或變體所示。

5、優(yōu)選地，所述car的抗原為cd19，所述重組構(gòu)建體編碼的氨基酸序列如seq?idno.1所示、其片段或變體所示。

6、優(yōu)選地，所述car的抗原為cldn18.2，所述重組構(gòu)建體中靶向cldn18.2部分核酸序列如seq?id?no.14所示、其片段或變體所示；所述重組構(gòu)建體中il-10的核酸序列如seq?idno.11所示、其片段或變體所示；所述重組構(gòu)建體中il-15的核酸序列如seq?id?no.12所示、其片段或變體所示。

7、優(yōu)選地，所述car的抗原為cldn18.2，所述重組構(gòu)建體中靶向cldn18.2部分的氨基酸序列如seq?id?no.13所示、其片段或變體所示；所述重組構(gòu)建體中il-10編碼的氨基酸序列如seq?id?no.5所示、其片段或變體所示；所述重組構(gòu)建體中il-15編碼的氨基酸序列如seq?id?no.6所示、其片段或變體所示。

8、優(yōu)選地，所述car的抗原為bcma，所述重組構(gòu)建體中靶向bcma的部分核酸序列如seq?id?no.16所示、其片段或變體所示；所述重組構(gòu)建體中il-10的核酸序列如seq?idno.11所示、其片段或變體所示；所述重組構(gòu)建體中il-15的核酸序列如seq?id?no.12所示、其片段或變體所示。

9、優(yōu)選地，所述car的抗原為bcma，所述重組構(gòu)建體中靶向bcma部分的氨基酸序列如seq?id?no.15所示、其片段或變體所示；所述重組構(gòu)建體中il-10編碼的氨基酸序列如seqid?no.5所示、其片段或變體所示；所述重組構(gòu)建體中il-15編碼的氨基酸序列如seq?idno.6所示、其片段或變體所示。

10、一種car修飾的細(xì)胞，包括前述任一所述的一種重組構(gòu)建體。

11、優(yōu)選地，所述的car修飾的細(xì)胞為car-nk細(xì)胞或car-t細(xì)胞的任意一種。

12、優(yōu)選地，所述的car修飾的細(xì)胞是自體的、同種異體的或異源的。

13、一種藥物組合物，包括前述任意一項(xiàng)所述的一種重組構(gòu)建體或前述任意一項(xiàng)所述的一種car修飾的細(xì)胞以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。

14、前述任意一項(xiàng)所述的一種重組構(gòu)建體或前述任意一項(xiàng)所述的car修飾的細(xì)胞或前述所述的藥物組合物在制備用于診斷/治療惡性腫瘤或自身免疫性疾病的試劑盒中的用途。

15、前述任意一項(xiàng)所述的一種重組構(gòu)建體或前述任意一項(xiàng)所述的car修飾的細(xì)胞或前述所述的藥物組合物在制備惡性腫瘤或自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。

16、優(yōu)選地，所述的惡性腫瘤為胃腺癌、b細(xì)胞惡性腫瘤或骨髓瘤的任意一種。

17、本發(fā)明的目的在于提供一種雙細(xì)胞因子分泌型car修飾的細(xì)胞的制備方法及其在細(xì)胞治療領(lǐng)域的應(yīng)用。

18、在本發(fā)明中，提供了一種表達(dá)載體(嵌合抗原受體表達(dá)載體)，其包含信號(hào)肽，胞外靶標(biāo)識(shí)別區(qū)(抗原結(jié)合區(qū))，鉸鏈區(qū)，跨膜區(qū)，胞內(nèi)區(qū)，特別的通過(guò)furin-t2a短肽協(xié)同共表達(dá)了il-10和il-15細(xì)胞因子，表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體。

19、例如，提供了一種宿主細(xì)胞，雙細(xì)胞因子分泌的嵌合抗原受體-nk細(xì)胞(car-nk)的制備，包含上述抗原識(shí)別區(qū)的car表達(dá)載體，宿主細(xì)胞是免疫細(xì)胞，例如t細(xì)胞，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(til)，自然殺傷細(xì)胞(nk)，自然殺傷t細(xì)胞(nkt)。

20、提供了一種殺傷效率檢測(cè)方法，具體包括：熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，長(zhǎng)時(shí)程的實(shí)時(shí)體外殺傷實(shí)驗(yàn)(rtca實(shí)驗(yàn))，cd107a脫顆粒實(shí)驗(yàn)；實(shí)施例中所述殺傷功能檢測(cè)方法，包括并不限于以上所述方法，例如if-g檢測(cè)，顆粒酶b(granzyme?b)檢測(cè)，穿孔素(perforin)檢測(cè)等。

21、在一種或多種實(shí)施例中，例如，nk細(xì)胞可以為：臍帶血來(lái)源nk細(xì)胞，包括但不限于臍帶血來(lái)源，例如外周血，ips誘導(dǎo)型，nk細(xì)胞系。

22、在一種或多種實(shí)施方式中，抗原包括但不限于：cldn18.2、cd19，cd5、cd20、cd22、cd23、cd30、cd33、cd34、cd37、cd38、cd43、cd72a、cd78、cd79a、cd79b、cd86、cd134、cd137、cd138、cd319、gpc3、cd32b、cd171、cs-1、cll-1、bcma、gd2、gd3、psma、ror1、flt3、fap、cd44v6、cea、epcam、b7h3、il-13ra2、mesothelin、her2、muc1、egfr、cldn6、dll3、nyeso-1、wt1、nectin-4、gpc3、pdl1、nkg2dl以及以上抗原的任意組合。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所達(dá)到的有益效果是：在基于不同抗原靶點(diǎn)，例如cd19、cldn18.2或bcma，靶向cd19?car-nk或car-t主要清除b細(xì)胞，應(yīng)用于b細(xì)胞惡性腫瘤，如b細(xì)胞白血病和淋巴瘤的治療，或者自身抗體相關(guān)的自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。cldn1?8.2主要表達(dá)在胃癌和胰腺癌等消化道腫瘤，靶向cldn1?8.2的car-nk可以應(yīng)用于相應(yīng)腫瘤的治療。靶向bcmacar-nk主要治療多發(fā)性骨髓瘤，也可以用于自身抗體相關(guān)的自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。以上多種不同抗原靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)不同腫瘤異常表達(dá)的客觀基礎(chǔ)上，以其作為臨床治療的靶點(diǎn)；在不改變嵌合抗原表達(dá)的情況下，協(xié)同分泌兩種細(xì)胞因子；增強(qiáng)了免疫細(xì)胞的長(zhǎng)期治療效果，同時(shí)降低治療風(fēng)險(xiǎn)。

24、白介素10(il-10)是一種多功能的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，其在腫瘤生物學(xué)中的作用尤為復(fù)雜，具有促進(jìn)和抑制腫瘤的雙重功能。一些研究表明il-10能抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，但是il-10也可以通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和免疫逃逸?；趇l-10與具有促進(jìn)和抑制腫瘤的雙重功能，將il-10改造car-nk細(xì)胞的效果無(wú)法預(yù)知，本技術(shù)創(chuàng)造性的將il-10應(yīng)用于car-nk或者car-t的細(xì)胞改造，再結(jié)合白介素15(il-15)進(jìn)行雙分泌細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)，具有意想不到的技術(shù)效果。