本發(fā)明屬于生物煉制，涉及一株產(chǎn)d-乳酸的戊糖乳桿菌及其在利用木質(zhì)纖維素原料產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：1、在眾多的生物基產(chǎn)品中，由于較好的材料性能、易降解性和適宜的價格，以乳酸為單體制備的聚乳酸具有非常高的應(yīng)用價值和經(jīng)濟價值。目前，聚乳酸已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械、食品包裝、注塑和增材制造。隨著生產(chǎn)成本的下降，聚乳酸在農(nóng)業(yè)薄膜、超市塑料袋等大宗領(lǐng)域也具有非常大的應(yīng)用潛力。根據(jù)聚合單體的不同，聚乳酸分為d型和l型，分別由d-型乳酸和l-型乳酸為單體制備而成。根據(jù)現(xiàn)在常用的丙交酯為關(guān)鍵中心物的乳酸合成路線，只有光學(xué)純度>95％的乳酸才適合用來制備聚乳酸(swetha?t?a,bora?a,mohanrasu?k,et?al.acomprehensive?review?on?polylactic?acid(pla)-synthesis,processing?andapplication?in?food?packaging[j].international?journal?of?biologicalmacromolecules,2023,234:123715.)。盡管d-型聚乳酸和l-型聚乳酸具有許多相似的特征，但在某些性質(zhì)上仍存在顯著差異，這決定了兩者在細分領(lǐng)域的不同應(yīng)用。例如d-型聚乳酸被生物降解的速度更慢，適合一些對于使用周期長的材料；l-型聚乳酸的生物相容性更好，可以用來制備一些生物醫(yī)學(xué)材料。此外，將d-型聚乳酸添加到用于塑料制造的l-型聚乳酸中，可以提高目標(biāo)產(chǎn)品的熔點。2、由于生產(chǎn)效率高、操作簡單，生物合成幾乎完全取代了化學(xué)合成生產(chǎn)乳酸?，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)識到，高效發(fā)酵菌株、廉價原料、簡單的發(fā)酵和純化工藝是商業(yè)規(guī)模發(fā)酵成功的關(guān)鍵因素。與工業(yè)上廣泛應(yīng)用的l-乳酸菌株相比，d-乳酸的研究還存在著很大的差距。其中一個主要的制約因素是只有少數(shù)微生物有著產(chǎn)生純d-乳酸的能力，使用野生菌時，幾乎無法實現(xiàn)純d-乳酸的生產(chǎn)。3、目前用來生產(chǎn)乳酸的微生物主要分為兩大類，一類是天然能夠產(chǎn)生乳酸的細菌，包括植物乳酸桿菌、乳酸片球菌、凝結(jié)芽孢桿菌、戊糖乳桿菌等；一類是工程改造的微生物，包括大腸桿菌、釀酒酵母等。戊糖乳酸桿菌(lactobacillus?pentosus)作為一種乳酸桿菌屬的微生物，可以高效利用生物質(zhì)酶解后產(chǎn)生的木糖、阿拉伯糖等多種糖類，同時對其中的抑制物也有良好的耐受性，這使得戊糖乳酸桿菌成為一種很理想的乳酸生產(chǎn)菌株，已經(jīng)應(yīng)用于多個研究之中。但是作為一種異型發(fā)酵乳酸菌，這極大地限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。4、野生戊糖乳酸桿菌生成的乳酸是d/l混合型的原因是野生菌株中同時存在d-乳酸脫氫酶和l-乳酸脫氫酶。通過遺傳改造的方法敲除l-乳酸脫氫酶的基因使菌株喪失l-乳酸脫氫酶的活力可以使得工程菌株不再產(chǎn)生l-乳酸，進而合成的乳酸為光學(xué)純的d-乳酸。但是，由于遺傳轉(zhuǎn)化方法和遺傳操作工具的限制，現(xiàn)在許多優(yōu)秀的野生菌還無法進行基因工程改造，因此無法通過這種理性代謝改造的方式獲得d-乳酸突變體。此外，有些代謝工程改造可能會殘留抗生素抗性基因片段及其他外源dna片段在菌株中，限制了相關(guān)菌株在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域的應(yīng)用。5、化學(xué)誘變是一種傳統(tǒng)的微生物誘變育種方式，其主要是利用化學(xué)物質(zhì)作用于微生物dna，使其遺傳物質(zhì)發(fā)生變化。因不涉及外源dna片段的導(dǎo)入，獲得的微生物突變體可以應(yīng)用在多個領(lǐng)域?；瘜W(xué)誘變劑多種多樣，甲基磺酸乙酯(ethyl?methane?sulfonate，ems)是烷化劑中的一種，微溶于水，可溶于乙醇，是一種強力致癌物質(zhì)。ems可誘導(dǎo)鳥嘌呤-胞嘧啶(g/c)堿基被取代為腺嘌呤-胸腺嘧啶(a/t)，ems還可在基因組中產(chǎn)生點突變和單核苷酸多態(tài)性(snyman?m,huynh?t?v,smith?m?t,et?al.the?genome-wide?rate?and?spectrumofems-induced?heritable?mutations?in?the?microcrustacean?daphnia:on?theprospect?of?forward?genetics[j].heredity,2021,127(6):535-545.)。在作用過程中，ems的誘變濃度和作用時間與菌株致死率之間存在著嚴(yán)格相關(guān)性。因此，在作用于菌株之前，應(yīng)先對其工作濃度和工作時間進行嚴(yán)密測試。技術(shù)實現(xiàn)思路1、本發(fā)明提供一種穩(wěn)定高效利用木質(zhì)纖維素水解液中的多種糖分的產(chǎn)d-乳酸的戊糖乳桿菌及其在利用木質(zhì)纖維素原料產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用。該菌株是由一株產(chǎn)d-/l-混合型乳酸的野生菌株通過甲基磺酸乙酯誘變獲得?；瘜W(xué)誘變使野生菌株中的l-乳酸脫氫酶發(fā)生了失活突變，喪失了合成l-乳酸的能力，因此該突變菌株合成的乳酸為光學(xué)純d-乳酸。除了具備光學(xué)純d-乳酸的特征外，該突變菌株保留了野生菌株對葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖在內(nèi)的多種底物高效的利用能力、高速率的乳酸合成能力和對木質(zhì)纖維素水解液中抑制物的耐受能力，使其能夠利用木質(zhì)纖維素原料制備光學(xué)純d-乳酸。2、本發(fā)明所述的產(chǎn)d-乳酸的戊糖乳桿菌(lactobacillus?pentosus)，為戊糖乳酸桿菌-mxw，已于2025年2月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc?no.33655。3、上述產(chǎn)d-乳酸的戊糖乳桿菌的培養(yǎng)方法采用現(xiàn)有常規(guī)的戊糖乳桿菌的方法，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為乳桿菌常用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中所用碳源為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖中的一種或幾種。培養(yǎng)方法為將菌株接種在mrs培養(yǎng)基中，37℃、ph＝6.5的條件下動態(tài)培養(yǎng)。4、上述戊糖乳酸桿菌在利用木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵生產(chǎn)d-乳酸中的應(yīng)用。5、本發(fā)明所述的木質(zhì)纖維素原料為生物煉制領(lǐng)域常規(guī)使用的含木質(zhì)纖維素的生物質(zhì)原料，選自小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈、大麥秸稈、高粱秸稈、大豆秸稈、林業(yè)廢料、回收木漿纖維、木屑、軟木、硬木、水草、水生植物、藻類以及動物糞便中的一種或者多種。6、進一步地，上述應(yīng)用的具體方法為：將戊糖乳酸桿菌-mxw接種于木質(zhì)纖維素水解液中，生產(chǎn)d-乳酸。7、本發(fā)明所述的木質(zhì)纖維素水解液為生物煉制領(lǐng)域常見的對木質(zhì)纖維素原料經(jīng)酸、堿等方式預(yù)處理后經(jīng)水解酶水解后獲得的水解液。在本發(fā)明具體實施方式中，以硫酸預(yù)處理后加纖維素酶酶解后獲得的水解液為例。8、本發(fā)明所述的水解酶為木質(zhì)纖維素原料生物煉制領(lǐng)域常規(guī)使用的水解酶，選自纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶中的一種或者多種組合。9、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點：10、(1)本發(fā)明利用甲基磺酸乙酯誘變技術(shù)，獲得了一株戊糖乳酸桿菌產(chǎn)純d-乳酸的突變株——戊糖乳酸桿菌-mxw。該菌株產(chǎn)生的d-乳酸手性純度達到98.2％，完全可用于合成聚乳酸。11、(2)本發(fā)明菌株具備利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等多種糖產(chǎn)d-乳酸的能力，同時能耐受木質(zhì)纖維素水解液中的各種抑制物，可不經(jīng)過水洗等脫毒步驟進行高效發(fā)酵。3l發(fā)酵罐中戊糖乳酸桿菌-mxw利用30％固載玉米秸稈酶解液發(fā)酵產(chǎn)d-乳酸，最終乳酸濃度可以達到128.3g/l；物料衡算表明，當(dāng)固載為30％時，1kg玉米秸稈可以生成300.4g?d-乳酸；對3l發(fā)酵罐中的d-乳酸進行純化，回收率可達到63.1％，d-乳酸化學(xué)純度可達到99.2％。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12