本申請(qǐng)涉及烏蘇里黃顙魚性別鑒定，尤其涉及一種用于烏蘇里黃顙魚性別鑒定的特異性dna片段及性別鑒定的方法。

背景技術(shù)：

1、烏蘇里黃顙魚（ pseudobagrus?ussuriensis）又名烏蘇里擬鲿，隸屬鲇形目、鲿科、擬鲿屬，俗稱牛尾巴。體長(zhǎng)，頭扁平，前部寬厚，后部側(cè)扁，體表光滑無(wú)鱗。廣泛分布于黑龍江、烏蘇里江、珠江等水域。烏蘇里黃顙魚肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，且無(wú)肌間刺，在我國(guó)北方被視為魚中珍品，備受廣大消費(fèi)者的青睞。目前對(duì)于烏蘇里黃顙魚的研究多集中在人工繁育、養(yǎng)殖、營(yíng)養(yǎng)以及生理等方面，與單性育種相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)還沒有突破性進(jìn)展。

2、烏蘇里黃顙魚具有顯著的雌雄二態(tài)性，雌雄個(gè)體在體型上存在明顯的差異，雄性個(gè)體顯著大于雌性個(gè)體。因此，開展烏蘇里黃顙魚全雄苗種繁育研究，進(jìn)行單性養(yǎng)殖對(duì)提高其養(yǎng)殖產(chǎn)量具有重要意義。

3、為此，中國(guó)發(fā)明專利cn2020111663121公開了用于烏蘇里擬鲿性別檢測(cè)的多重pcr引物及檢測(cè)方法，在該方法中，通過整合三個(gè)性別特異性標(biāo)記，構(gòu)建了烏蘇里擬鲿性別檢測(cè)的多重pcr體系，用于烏蘇里擬鲿性別鑒定，即烏蘇里黃顙魚的性別鑒定。

4、然而，在上述引物設(shè)計(jì)和鑒定方法中，存在如下缺點(diǎn)：1、性別特異序列部分：對(duì)專利cn2020111663121中采用的3段性別特異序列在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)，并未在烏蘇里黃顙魚參考基因組中比對(duì)到同源序列。這表明該專利采用的3段性別特異序列是具有種群特異性的。如在烏蘇里黃顙魚參考基因組測(cè)序種群中應(yīng)用該方法開展性別鑒定時(shí)，會(huì)因?yàn)樵撊后w不含有該3段序列，而導(dǎo)致鑒定失敗。2、引物部分：多個(gè)引物可能會(huì)發(fā)生相互干擾，導(dǎo)致引物之間的競(jìng)爭(zhēng)作用或擴(kuò)增效率降低，甚至引發(fā)非特異性擴(kuò)增；3、鑒定方法部分：上述方案鑒定性別時(shí)需要同時(shí)判斷個(gè)體在246?bp、597?bp和823?bp處是否有無(wú)擴(kuò)增條帶，無(wú)論是引物的反應(yīng)體系或是鑒別方法都非常麻煩，不能直觀得出。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種用于烏蘇里黃顙魚性別鑒定的特異性dna片段及性別鑒定的方法，該方案具有特異性強(qiáng)、引物組成簡(jiǎn)單以及可更直觀快速地鑒定烏蘇里黃顙魚性別的優(yōu)點(diǎn)。

2、本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

3、一種用于烏蘇里黃顙魚性別鑒定的特異性dna片段，特異性dna片段的序列為見seq?id?no:1。

4、作為優(yōu)選，設(shè)計(jì)得到的性別特異性引物包括正向引物fp和反向引物rp；

5、正向引物fp：5’-gtagctgagaggagtaactggtgga-3’；seq?id?no:2；

6、反向引物rp：5’-acaggtgagcacctcagcacca-3’；seq?id?no:3。

7、本發(fā)明還提供了一種烏蘇里黃顙魚性別鑒定的方法，該方法包括以下步驟：采用所述的pcr引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果出現(xiàn)356bp條帶的為雄性，無(wú)特異性條帶出現(xiàn)的則為雌性。用于烏蘇里黃顙魚性別鑒定的pcr擴(kuò)增序列，為見seq?id?no:4。

8、作為優(yōu)選，所述pcr擴(kuò)增條件：94℃，4min；94℃，30s，66℃，30s，72℃，30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

9、作為優(yōu)選，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系共20μl為：2×premix?taq?10μl，10mm引物各0.8μl，ddh2o?7.4μl，基因組dna?1μl。

10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)的技術(shù)方案所具備的優(yōu)點(diǎn)或有益效果包括：

11、1、本申請(qǐng)的鑒定方法中，只需要判斷結(jié)果無(wú)特異性條帶的即為雌性，有356bp條帶即為雄性，更加直觀且準(zhǔn)確率高。

12、2、性別特異性序列源于多個(gè)烏蘇里黃顙魚雌雄個(gè)體重測(cè)序數(shù)據(jù)。通過設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，分別與目標(biāo)dna序列的兩端結(jié)合，從而確保擴(kuò)增的特異性和物種內(nèi)不同地理群體的通用性。?

技術(shù)特征：

1.一種用于烏蘇里黃顙魚性別鑒定的特異性dna片段，其特征在于，雄性特異性dna片段的序列為seq?id?no:1。

2.一種用于烏蘇里黃顙魚性別鑒定的引物，其特征在于，由特異性dna片段seq?id?no:1設(shè)計(jì)得到，所述引物序列為：

3.一種烏蘇里黃顙魚性別鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：利用所述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)356bp單帶的個(gè)體為雄性烏蘇里黃顙魚，無(wú)特異性條帶出現(xiàn)的個(gè)體為雌性烏蘇里黃顙魚；其中，pcr擴(kuò)增序列如seq?id?no:4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種烏蘇里黃顙魚性別鑒定方法，其特征在于，?pcr擴(kuò)增條件為：94℃，4min；94℃，30s，66℃，30s，72℃，30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種烏蘇里黃顙魚性別鑒定方法，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系共20μl為：2×premix?taq?10μl，10mm正反向引物各0.8μl，ddh2o?7.4μl，基因組dna?1μl。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)公開了一種用于烏蘇里黃顙魚性別鑒定的特異性DNA片段及性別鑒定的方法，具體涉及烏蘇里黃顙魚性別鑒定技術(shù)領(lǐng)域。上述鑒定的方法包括以下步驟：將全同胞家系的5尾雌性和5尾雄性烏蘇里黃顙魚進(jìn)行解剖確定生理性別；分別取雌性樣本和雄性樣本的肌肉進(jìn)行DNA提取，構(gòu)建插入片段大小為300bp的雙末端基因組DNA文庫(kù)，進(jìn)行高通量測(cè)序；基于GWAS和Fst方法，鑒定烏蘇里黃顙魚性染色體為8號(hào)染色體，隨后在8號(hào)染色體上的性別決定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行Indel篩選；篩選到一條601bp的雄性特異性DNA序列，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)合成；利用PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果無(wú)特異性條帶的為雌性，有356bp條帶的為雄性。該方案具有特異性強(qiáng)、引物組成簡(jiǎn)單以及更直觀地鑒定烏蘇里黃顙魚性別的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：翁旭東,許曉軍,張新輝,簡(jiǎn)杰亮
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8