本技術(shù)涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種納米球偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用，以及一種微球偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、流式細胞術(shù)是一種通過單個或多個激光器，對懸浮在緩沖溶液中的單個細胞或顆粒進行快速分析的技術(shù)?？梢姽馍⑸涫窃趦蓚€不同的方向(前散射fsc和側(cè)散射ssc)測量的。它們分別可以指示待測物的相對大小以及細胞內(nèi)的復(fù)雜程度。可以通過轉(zhuǎn)染和表達熒光蛋白、用熒光染料染色或使用熒光偶聯(lián)抗體免疫染色進行熒光測量的樣品的制備。

2、流式細胞術(shù)是一種強大的工具，在免疫學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)、癌癥生物學(xué)和傳染病監(jiān)測等多個學(xué)科都有應(yīng)用。例如它能夠?qū)ν饷隗w進行分群及檢測，以評估外泌體來源相關(guān)疾病標志物的表達情況。除了分析外泌體之外，它還可以對血液中的循環(huán)腫瘤細胞(ctc)進行檢測，并基于其標志物的信號高低對腫瘤發(fā)展情況進行評估。流式細胞術(shù)也可以將血液和骨髓的混合細胞群以及可以解離成單個細胞的實體組織，例如淋巴結(jié)、脾臟、粘膜組織、實體瘤等，用于進一步的下游分析。納米流式技術(shù)屬于更靈敏的流式平臺，其檢測覆蓋了傳統(tǒng)流式細胞儀200nm以下粒徑檢測的盲區(qū)，囊括了納米顆粒以及亞細胞結(jié)構(gòu)，細菌，病毒，細胞外囊泡(外泌體)等的天然生物納米顆粒。在此基礎(chǔ)上還有液相芯片技術(shù)，其特點是支持多元化的應(yīng)用、多指標聯(lián)合檢測、提升檢測通量及靈活組合，能滿足不同的臨床應(yīng)用場景。

3、但目前以上平臺檢測存在以下客觀缺點：

4、1)天然的細胞或生物活性顆粒數(shù)量及分布有著明顯的個體、組織、時空間差異，更會受到疾病狀態(tài)的影響。因此相關(guān)顆粒標志物檢測的預(yù)期數(shù)值并非是一成不變的。相應(yīng)標準品或質(zhì)控品的缺失將會導(dǎo)致無法確認檢測數(shù)值變化是細胞或生物活性顆粒自身引起的，還是檢測系統(tǒng)不穩(wěn)定引起的。上述情況均會導(dǎo)致細胞或生物活性顆粒標志物檢測重現(xiàn)性較差。

5、2)直接使用單一批次提純的細胞或生物活性顆粒(如外泌體)可以作為標準品于多次實驗中使用，但是細胞或生物活性顆粒的獲取一般較為復(fù)雜，導(dǎo)致成本過高且無法大量穩(wěn)定獲得。因此天然的細胞或生物活性顆粒并不適合作為校準品或質(zhì)控品進行大范圍應(yīng)用。與此同時，不同來源的細胞或生物活性顆粒粒徑并不均一，其對粒徑的質(zhì)控作用也比較差?；诖耍兓募毎蛏锘钚灶w粒并不適合作為外泌體相關(guān)檢測的標準品或質(zhì)控品。

6、3)細胞或生物活性顆粒的表面分布著諸多標志物蛋白，其不同標志物蛋白豐度并不完全相同。由于缺少標準品和質(zhì)控品，豐度較低蛋白檢測體系的建立因為無法判定是樣本損失還是檢測系統(tǒng)靈敏度不足而顯得尤為困難。因此目前仍需要一款可以定制粒徑和標志物的微球偶聯(lián)物來作為標準品或質(zhì)控品，幫助建立細胞或生物活性顆粒標志物檢測方法的建立。

7、綜上，目前流式平臺檢測由于缺少相應(yīng)的標準品，難以進行多批次樣本數(shù)據(jù)的平行比較，也難以對數(shù)據(jù)進行定量化處理。與此同時，該平臺也缺少相應(yīng)的質(zhì)控品對檢測系統(tǒng)的性能和檢測的可重復(fù)性進行質(zhì)控。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于現(xiàn)有技術(shù)中存在上述問題，本技術(shù)提供一種可定制粒徑和標志物蛋白的納米球偶聯(lián)物和一種微球偶聯(lián)物，作為標準品或質(zhì)控品應(yīng)用于現(xiàn)有的流式平臺檢測中。本技術(shù)的微球偶聯(lián)物能解決上述不足，能夠幫助流式平臺細胞或生物活性顆粒標志物檢測方法的建立并提升測定的可重復(fù)性。本技術(shù)的納米球偶聯(lián)物和微球偶聯(lián)物可以放大生產(chǎn)且能夠定制標志物和粒徑大小，其可以作為校準品對不同的待測物進行半定量檢測，也可以作為質(zhì)控品，對反應(yīng)體系或檢測儀器進行質(zhì)量控制，有效提升檢測系統(tǒng)的重復(fù)性。

2、本技術(shù)的具體技術(shù)方法如下：

3、1.一種納米球偶聯(lián)物，其中，所述納米球偶聯(lián)物為外泌體表面標志物蛋白與納米球偶聯(lián)得到的復(fù)合物，所述納米球的平均粒徑為10～800nm，優(yōu)選為30～160nm。

4、2.根據(jù)項1所述的納米球偶聯(lián)物，其中，所述外泌體表面標志物蛋白選自cd63蛋白、cd81蛋白、cd9蛋白、hsp60蛋白、hsp70蛋白、hspa5蛋白、cct2蛋白和hsp90蛋白中的任意一種或兩種以上。

5、3.根據(jù)項1或2所述的納米球偶聯(lián)物，其中，所述納米球為羧基修飾的納米球；

6、優(yōu)選地，所述納米球為膠體金納米球或pbs納米球，更優(yōu)選為pbs納米球。

7、4.根據(jù)項2或3所述的納米球偶聯(lián)物，其中，所述外泌體表面標志物蛋白的質(zhì)量與所述納米球的質(zhì)量之比為0.00075～0.003:1，優(yōu)選為0.001～0.003:1。

8、5.根據(jù)項1～4中任一項所述的納米球偶聯(lián)物，其中，所述外泌體表面標志物蛋白為cd63蛋白和cd9蛋白，優(yōu)選所述cd63蛋白與cd9蛋白的質(zhì)量比為1～3:1。

9、6.一種納米球偶聯(lián)物的制備方法，其中，所述制備方法包括下述步驟：

10、活化：取平均粒徑為10～800nm、優(yōu)選為30～160nm的納米球，加入偶聯(lián)劑進行活化，得到活化后的納米球；

11、偶聯(lián)：取外泌體表面標志物蛋白加入到所述活化后的納米球中，孵育，離心，吸取上清；

12、保存：加入保存緩沖液進行重懸，得到納米球偶聯(lián)物。

13、7.根據(jù)項5所述的制備方法，其中，在所述活化步驟中，所述納米球為膠體金納米球或pbs納米球，優(yōu)選為pbs納米球。

14、8.根據(jù)項6或7所述的制備方法，其中，在所述活化步驟中，取納米球懸液，分散于反應(yīng)緩沖液或者蒸餾水中，震蕩混勻，加入偶聯(lián)劑，孵育，離心，吸取上清后，分散于反應(yīng)緩沖液或者蒸餾水中；

15、優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液為mes緩沖液；

16、優(yōu)選地，以edc和nhs作為偶聯(lián)劑；

17、優(yōu)選地，加入偶聯(lián)劑后孵育的時間為0.3～0.8h，更優(yōu)選為0.4～0.6h。

18、9.根據(jù)項7或8所述的制備方法，其中，

19、所述外泌體表面標志物蛋白選自cd63蛋白、cd81蛋白、cd9蛋白、hsp60蛋白、hsp70蛋白、hspa5蛋白、cct2蛋白和hsp90蛋白中的任意一種或兩種以上；

20、優(yōu)選地，所述外泌體表面標志物蛋白的質(zhì)量與所述納米球的質(zhì)量之比為0.00075～0.003:1，優(yōu)選為0.001～0.003:1；

21、優(yōu)選地，所述外泌體表面標志物蛋白為cd63蛋白和cd9蛋白，進一步優(yōu)選所述cd63蛋白與cd9蛋白的質(zhì)量比為1～3:1。

22、10.根據(jù)項6～9中任一項所述的制備方法，其中，在所述偶聯(lián)步驟中，孵育的時間為1～3h，優(yōu)選為1.5～2.5h；

23、優(yōu)選地，在所述偶聯(lián)步驟中，孵育后以5000～10000rpm離心3～8min。

24、11.根據(jù)項6～10中任一項所述的制備方法，其中，在所述保存步驟中，加入保存緩沖液進行重懸，震蕩混勻后1～8℃過夜，得到納米球偶聯(lián)物；

25、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含bsa的pbs緩沖液；

26、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含bsa、tween-20和bnd防腐劑的pbs緩沖液；

27、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含0.5％～1.5％bsa、0.05％～0.3％tween-20和0.05％～0.2％bnd防腐劑的pbs緩沖液；

28、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含0.8％～1.2％bsa、0.08％～0.15％tween-20和0.08％～0.12％bnd防腐劑的pbs緩沖液。

29、12.根據(jù)項6～11中任一項所述的制備方法，其中，所述納米球偶聯(lián)物為項1～5中任一項所述的納米球偶聯(lián)物。

30、13.項1～5中任一項所述的納米球偶聯(lián)物或項6～11中任一項所述的制備方法制得的納米球偶聯(lián)物作為外泌體標準品的應(yīng)用。

31、14.一種微球偶聯(lián)物，其中，所述微球偶聯(lián)物為細胞表面蛋白與微球偶聯(lián)得到的復(fù)合物，所述微球的平均粒徑為1～8μm。

32、15.根據(jù)項14所述的微球偶聯(lián)物，其中，所述細胞表面蛋白選自cd3、cd4、cd8和cd28中的一種或兩種以上，優(yōu)選為cd3蛋白。

33、16.根據(jù)項14或15所述的微球偶聯(lián)物，其中，所述微球為羧基修飾的微球；

34、優(yōu)選地，所述微球為磁性微球或乳膠微球，更優(yōu)選為磁性微球。

35、17.根據(jù)項14～16中任一項所述的微球偶聯(lián)物，其中，所述細胞表面蛋白與所述微球的質(zhì)量之比為0.0025～0.01:1，優(yōu)選為0.004～0.006:1。

36、18.一種微球偶聯(lián)物的制備方法，所述制備方法包括下述步驟：

37、活化：取平均粒徑為1～8μm的微球，加入偶聯(lián)劑進行活化，得到活化后的微球；

38、偶聯(lián)：取細胞表面蛋白加入到所述活化后的微球中，孵育，離心，吸取上清；

39、保存：加入保存緩沖液進行重懸，得到微球偶聯(lián)物。

40、19.根據(jù)項18所述的制備方法，其中，所述微球為羧基修飾的微球；

41、優(yōu)選地，所述微球為磁性微球或乳膠微球，更優(yōu)選為磁性微球。

42、20.根據(jù)項18或19所述的制備方法，其中，在所述活化步驟中，將磁性微球加入離心管，磁吸附，去除上清，然后用反應(yīng)緩沖液平衡磁性微球，再次去除上清，隨后加入反應(yīng)緩沖液，再加入偶聯(lián)劑，孵育，磁吸附，吸去上清；

43、優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液為mes緩沖液；

44、優(yōu)選地，以edc和nhs作為偶聯(lián)劑；

45、優(yōu)選地，加入偶聯(lián)劑后孵育的條件為30～40℃孵育20～50min；

46、優(yōu)選地，加入偶聯(lián)劑后孵育的條件為37～40℃孵育25～40min。

47、21.根據(jù)項18～20中任一項所述的制備方法，其中，所述細胞表面蛋白選自cd3、cd4、cd8和cd28中的一種或兩種以上，優(yōu)選為cd3蛋白。

48、22.根據(jù)項18～21中任一項所述的制備方法，其中，所述細胞表面蛋白與所述微球的質(zhì)量之比為0.0025～0.01:1，優(yōu)選為0.004～0.006:1。

49、23.根據(jù)項18～22中任一項所述的制備方法，其中，在所述偶聯(lián)步驟中，清洗所述活化后的磁性微球2～5次，重懸，加入細胞表面蛋白，孵育，然后加入pbs稀釋的bsa，再孵育，孵育結(jié)束后以5000～10000rpm離心3～8min。

50、24.根據(jù)項18～23中任一項所述的制備方法，其中，在所述保存步驟中，加入保存緩沖液，磁吸附，吸去上清，然后再加入保存緩沖液重懸，得到所述微球偶聯(lián)物；

51、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含bsa的pbs緩沖液；

52、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含bsa、tween-20和bnd防腐劑的pbs緩沖液；

53、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含0.5％～1.5％bsa、0.05％～0.3％tween-20和0.05％～0.2％bnd防腐劑的pbs緩沖液；

54、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含0.8％～1.2％bsa、0.08％～0.15％tween-20和0.08％～0.12％bnd防腐劑的pbs緩沖液。

55、25.根據(jù)項18～25中任一項所述的制備方法，其中，所述微球偶聯(lián)物為權(quán)利要求14～17中任一項所述的微球偶聯(lián)物。

56、26.項14～17中任一項所述的微球偶聯(lián)物或項18～24中任一項所述的制備方法制得的微球偶聯(lián)物作為細胞質(zhì)控品的應(yīng)用。

57、27.一種納米球偶聯(lián)物或微球偶聯(lián)物的保存緩沖液，其中，所述保存緩沖液為包含bsa、tween-20和bnd防腐劑的pbs緩沖液。

58、28.根據(jù)項27所述的保存緩沖液，其中，所述保存緩沖液為包含0.5％～1.5％bsa、0.05％～0.3％tween-20和0.05％～0.2％bnd防腐劑的pbs緩沖液；

59、優(yōu)選地，所述保存緩沖液為包含0.8％～1.2％bsa、0.08％～0.15％tween-20和0.08％～0.12％bnd防腐劑的pbs緩沖液。

60、發(fā)明的效果

61、本技術(shù)的納米球偶聯(lián)物或微球偶聯(lián)物可以放大生產(chǎn)且能夠定制標志物和粒徑大小，本技術(shù)的納米球偶聯(lián)物或微球偶聯(lián)物的制備方法不限于粒徑和微球材質(zhì)/基團，均能獲得穩(wěn)定的偶聯(lián)物，能夠應(yīng)用于流式及液相芯片平臺。根據(jù)不同的粒徑，該納米球偶聯(lián)物或微球偶聯(lián)物可以作為標準品對不同的待測物進行半定量檢測；也可以作為質(zhì)控品，對反應(yīng)體系或檢測儀器進行質(zhì)量控制，有效提升檢測系統(tǒng)的重復(fù)性。