本發(fā)明涉及生物檢測，具體涉及一種靶向定量檢測血液中乳腺癌細(xì)胞的體系及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、長期以來，癌癥一直是一個(gè)引起廣泛關(guān)注的話題。乳腺癌因是女性癌癥死亡的主要原因而受到廣泛關(guān)注。因?yàn)槿橄侔┰诔跗跓o法被準(zhǔn)確診斷，所以其可能在未被察覺的情況下發(fā)展。因此癌癥的早期診斷和及時(shí)治療在提高患者生存率方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

2、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)是從原發(fā)腫瘤脫落后在外周血液中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。ctc被視為一種新型可靠的腫瘤生物標(biāo)志物，用于早期癌癥診斷，可以在轉(zhuǎn)移性和原發(fā)性腫瘤患者的外周血中被檢測到。然而，由于人類血液中ctc的濃度較低，不易檢測，準(zhǔn)確定量檢測和分析ctc對研究人員來說是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因此，在真實(shí)的人類血液樣本中快速捕獲和高靈敏檢測ctc的方法在癌癥檢測中的地位越來越重要，實(shí)現(xiàn)在超低水平ctc中的高靈敏檢測有利于早期乳腺癌的診斷和治療評估。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于目前存在的上述不足，本發(fā)明提供一種靶向定量檢測血液中乳腺癌細(xì)胞的體系及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明具有靈敏度高、檢出限低、成本低以及操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對血液中乳腺癌細(xì)胞的靈敏檢測。通過與已發(fā)表的乳腺癌細(xì)胞的檢測方法進(jìn)行對比，本方法具有可調(diào)控的檢測范圍和更低的檢出限，且解決了復(fù)雜基質(zhì)干擾問題，具有良好的應(yīng)用前景。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種靶向定量檢測血液中乳腺癌細(xì)胞的體系包括磁性納米粒子復(fù)合材料、ag納米粒子、第一修飾核酸鏈、第二修飾核酸鏈、過氧化氫溶液、磷酸緩沖鹽溶液、脲酶溶液、尿素溶液、酚紅溶液；其中

3、所述磁性納米粒子復(fù)合材料包括磁性fe3o4納米粒子和自聚合生長在所述fe3o4納米粒子表面的聚多巴胺；

4、所述第一修飾核酸鏈的核苷酸序列如seq?id?no：1所示，用于修飾所述磁性納米粒子復(fù)合材料。

5、需要說明的是，第一修飾核酸鏈與磁性納米粒子復(fù)合材料通過fe3o4納米粒子表面的聚多巴胺與第一修飾核酸鏈之間的金屬強(qiáng)配位進(jìn)行連接。

6、所述第二修飾核酸鏈的核苷酸序列如seq?id?no：2所示，用于修飾所述ag納米粒子。

7、依照本發(fā)明的一個(gè)方面，所述第二修飾核酸鏈的3’末端修飾有巰基，所述ag納米粒子與所述第二修飾核酸鏈通過ag-s鍵進(jìn)行連接。

8、依照本發(fā)明的一個(gè)方面，所述ag納米粒子的粒徑為75～300nm。

9、需要說明的是，磁性納米粒子復(fù)合材料的尺寸大小對信號輸出的影響不大。

10、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述磁性納米粒子復(fù)合材料的粒徑為150nm，所述聚多巴胺的厚度為17nm；

11、依照本發(fā)明的一個(gè)方面，所述過氧化氫溶液的濃度為10～30mm，所述磷酸緩沖鹽溶液的ph值為7.4，所述脲酶溶液的濃度為10nm，所述尿素溶液的濃度為100mm，所述酚紅溶液的濃度為100μm。

12、需要說明的是，磷酸緩沖鹽溶液的ph值為7.4是為了在生理?xiàng)l件下對癌細(xì)胞進(jìn)行捕獲，要保證癌細(xì)胞的形態(tài)正常，所以，其ph值是固定的普遍適用的值。

13、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述體系的制備方法，包括以下步驟：

14、s1、磁性納米粒子復(fù)合材料的制備：

15、基于水熱法合成磁性fe3o4納米粒子，再采用自聚合方式在所述磁性fe3o4納米粒子的表面生長聚多巴胺層；

16、s2、ag納米粒子的制備：

17、通過檸檬酸鈉還原法制備得到銀納米種子；再將所述銀納米種子、抗壞血酸、硝酸銀和氨水混合反應(yīng)，制備得到75-300nm的均勻準(zhǔn)球形的ag納米粒子。

18、依照本發(fā)明的一個(gè)方面，所述磁性納米粒子復(fù)合材料的制備方法包括以下步驟：

19、a1、將氯化鐵六水合物和醋酸鈉三水合物加入至溶劑中攪拌混勻，獲得混合物；向混合物中添加醋酸鈉并混勻后轉(zhuǎn)移到一個(gè)聚四氟乙烯襯里的高壓釜中并溫度升高至200℃反應(yīng)12h，再經(jīng)洗滌，得到fe3o4磁性納米粒子；

20、a2、將所述fe3o4磁性納米粒子與鹽酸多巴溶液加入tris-hcl緩沖溶液中反應(yīng)8h，再經(jīng)洗滌、冷凍干燥，得到磁性納米粒子復(fù)合材料，即fe3o4@pda納米粒子；其中，所述tris-hcl緩沖溶液的ph值為8.5。

21、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述靶向定量檢測血液中乳腺癌細(xì)胞的體系或上述制備方法制備得到的靶向定量檢測血液中乳腺癌細(xì)胞的體系在靶向定量檢測血液中乳腺癌細(xì)胞中的非疾病診斷和治療目的的應(yīng)用。

22、依照本發(fā)明的一個(gè)方面，包括以下步驟：

23、t1、在所述磁性納米粒子復(fù)合材料的表面修飾所述第一修飾核酸鏈，得到n1-fe3o4@pda納米粒子；將所述ag納米粒子的表面修飾所述第二修飾核酸鏈，得到s1-ag?nps復(fù)合物；

24、t2、在待測樣品中加入所述n1-fe3o4@pda并進(jìn)行孵育，形成癌細(xì)胞-磁性納米粒子偶聯(lián)產(chǎn)物；

25、t3、通過磁性分離將所述癌細(xì)胞-磁性納米粒子偶聯(lián)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至所述磷酸緩沖鹽溶液中，再加入所述s1-ag?nps并進(jìn)行孵育，形成磁性納米粒子-癌細(xì)胞-銀納米粒子三明治夾心結(jié)構(gòu)；

26、t4、將所述磁性納米粒子-癌細(xì)胞-銀納米粒子三明治夾心結(jié)構(gòu)加入到所述過氧化氫溶液中并進(jìn)行反應(yīng)后，取上清液加入所述脲酶溶液進(jìn)行孵育，再加入所述尿素溶液和酚紅溶液進(jìn)行孵育，記錄孵育后的溶液的紫外吸收信號。

27、依照本發(fā)明的一個(gè)方面，在所述磁性納米粒子復(fù)合材料的表面修飾所述第一修飾核酸鏈的過程具體為：

28、將所述磁性納米粒子復(fù)合材料和所述第一修飾核酸鏈加入含有ca2+的hepes緩沖溶液中孵育反應(yīng)2h，再通過磁分離法用hepes緩沖溶液多次洗滌，得到n1-fe3o4@pda納米粒子；

29、將所述ag納米粒子的表面修飾所述第二修飾核酸鏈的過程具體為：

30、將硫醇化的第二修飾核酸鏈用tcep孵育，再將其與ag納米粒子進(jìn)行混勻并孵育，獲得混合物；向所述混合物中依次加入檸檬酸緩沖液并混合、磷酸鹽緩沖液并混合，再經(jīng)離心，得到s1-ag?nps復(fù)合物。

31、依照本發(fā)明的一個(gè)方面，步驟t2中，加入n1-fe3o4@pda的孵育條件為37℃孵育120min；步驟t3中，加入s1-ag?nps的孵育條件為37℃孵育15min；步驟t4中，加入過氧化氫溶液的反應(yīng)時(shí)間為10min，加入脲酶溶液的孵育條件為37℃孵育15min。

32、本發(fā)明的檢測原理：

33、通過“一對多”的結(jié)合癌細(xì)胞和酶抑制策略實(shí)現(xiàn)對血液中乳腺癌細(xì)胞的雙重信號放大檢測。具體如圖1b所示，首先，在目標(biāo)癌細(xì)胞(簡稱ctcs)存在的情況下，n1-fe3o4@pda納米顆粒與s1-ag納米顆粒與乳腺癌細(xì)胞形成了三明治結(jié)構(gòu)。隨著銀納米顆粒尺寸的增大，被h2o2氧化的ag+數(shù)量也隨之增加。微量的銀離子能夠完全抑制脲酶的活性。這些被h2o2氧化的釋放ag+被視為信號單元作用于脲酶，從而抑制脲酶的活性。脲酶催化尿素的分解可以釋放大量的氨，使得溶液的ph上升，通過“一對多”的結(jié)合癌細(xì)胞和酶抑制策略實(shí)現(xiàn)雙重信號放大檢測。當(dāng)存在目標(biāo)乳腺癌細(xì)胞時(shí)，帶有特定核酸序列的銀納米粒子可與被磁性納米粒子捕獲的乳腺癌細(xì)胞結(jié)合形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，通過磁性富集與分離后，將磁性納米粒子-乳腺癌細(xì)胞-銀納米粒子偶聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)移至過氧化氫溶液中反應(yīng)，通過磁分離取上清液，加入脲酶進(jìn)行孵育，捕獲在乳腺癌細(xì)胞表面的ag納米粒子被過氧化氫溶液分解成的數(shù)以百萬計(jì)的銀離子與脲酶作用并抑制其活性。在含有尿素的溶液中，ph指示劑苯酚紅(ph＝5.8)顯示出黃色，并在430nm處和558nm處均出現(xiàn)特征吸收峰，且隨著乳腺癌細(xì)胞的增加，ag離子的濃度增加，極大程度地抑制了脲酶的活性，導(dǎo)致尿素的分解受到抑制，溶液的ph變化不明顯，苯酚紅在430nm處的吸收峰變高，558nm處的吸收峰越來越低(紫外吸收峰比值取決于乳腺癌細(xì)胞的濃度)。相反，在沒有乳腺癌細(xì)胞的情況下，溶液中的尿素在脲酶的催化下水解為氨，導(dǎo)致溶液ph值的升高。同時(shí)，隨著溶液堿性不斷升高，溶液的顏色從黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，并在558nm處的特征吸收峰越來越高，同時(shí)430nm處的吸收峰幾乎消失。

34、此外，單個(gè)癌細(xì)胞可以同時(shí)被多個(gè)銀納米粒子捕獲，這樣通過過氧化氫刻蝕可以釋放更多的銀離子，從而比單個(gè)ag納米粒子釋放的銀離子更大程度地抑制脲酶的活性，進(jìn)一步提高信號放大效果。通過控制合成不同粒徑的銀納米粒子，可以控制釋放銀離子數(shù)目，從而提高傳感器靈敏度。與常規(guī)比色生物傳感器相比，使用苯酚紅(苯酚紅對ph變化的敏感性極高，其解離常數(shù)(pka)為7.5，堿性形式的摩爾吸收系數(shù)(ε＝5.64×104m-1cm-1，558nm)能夠在6.5-8.5的范圍內(nèi)指示溶液ph的變化。)作為指示劑的生物傳感器的敏感變化可以通過肉眼和吸收光譜儀輕松分析，從而實(shí)現(xiàn)對乳腺癌細(xì)胞的定性和定量檢測。

35、本發(fā)明的有益效果：

36、(1)本發(fā)明通過對磁性納米粒子和銀納米粒子進(jìn)行核酸功能化修飾，乳腺癌細(xì)胞作為中間載體，可形成磁性納米粒子-癌細(xì)胞-銀納米粒子三明治夾心結(jié)構(gòu)，由于銀納米粒子的尺寸可調(diào)控，一個(gè)癌細(xì)胞可同時(shí)被多個(gè)銀納米粒子捕獲，對信號進(jìn)行了放大，在過氧化氫溶液的作用下，銀納米粒子被氧化成數(shù)以百萬計(jì)的銀離子，極大程度地抑制了脲酶的活性，能夠進(jìn)一步放大信號。而且，通過苯酚紅將脲酶催化尿素分解產(chǎn)生的氨的ph的信號變化轉(zhuǎn)換為苯酚紅紫外吸收峰的變化及肉眼可觀測出的顏色變化，也保證了反應(yīng)體系經(jīng)過磁分離富集后與顯色體系無接觸，避免了實(shí)際復(fù)雜血清或血液樣本對體系的干擾與影響。實(shí)驗(yàn)中將血清和血液作為實(shí)際樣品，對該方法的抗干擾能力進(jìn)行了探究，通過在復(fù)雜體系中加標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方式，驗(yàn)證該方法在復(fù)雜基質(zhì)中具有良好的檢測性能。

37、(2)本發(fā)明具有靈敏度高、檢出限低、成本低以及操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對血液中乳腺癌細(xì)胞的靈敏檢測。通過與已發(fā)表的乳腺癌細(xì)胞的檢測方法進(jìn)行對比，本方法具有可調(diào)控的檢測范圍和更低的檢出限，且解決了復(fù)雜基質(zhì)干擾問題，具有良好的應(yīng)用前景。