本發(fā)明涉及化妝品，具體涉及一種用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)干細(xì)胞提取物組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、毛發(fā)作為皮膚器官重要的附屬器之一，是哺乳動(dòng)物的獨(dú)特特征。毛發(fā)的主要功能包括保護(hù)皮膚免受機(jī)械傷害、保溫、感官功能等。正常人每天大約會(huì)掉落50-100根頭發(fā)，脫落的頭發(fā)數(shù)量大于100根/天時(shí)則被定義為脫發(fā)。禿頭癥(頭發(fā)從頭皮脫落)由于各種原因而發(fā)生，例如內(nèi)在誘因(如遺傳組成和雄性激素的作用)；日常生活中的精神壓力；以及外部誘因(如頭皮中的脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累)。已知脫發(fā)癥狀由非常復(fù)雜的過(guò)程引起。為了改善這種脫發(fā)，多種類型的毛發(fā)生長(zhǎng)液是在商業(yè)上可得的。

2、目前，僅有通過(guò)美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(fda)批準(zhǔn)的兩種藥物，例如在1998年(約15年前)公布的米諾地爾(minoxidil)和非那司提(finasteride)，因此，僅用這兩種藥物不能完全治愈各種原因的禿頭癥。由于市場(chǎng)上的毛發(fā)生長(zhǎng)液具有由激素藥物的應(yīng)用所引起的副作用，并僅對(duì)其中發(fā)根被激活的部分有效，它們?cè)陬A(yù)防脫發(fā)中有效，但對(duì)處于長(zhǎng)期休止期的毛發(fā)的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著效果，而且必須連續(xù)給予或施用。因此，有必要開(kāi)發(fā)用于禿頭癥或頭發(fā)稀疏的經(jīng)濟(jì)且穩(wěn)定的技術(shù)。在韓國(guó)，相比發(fā)達(dá)國(guó)家，用于禿頭癥的藥物的研發(fā)在技術(shù)上不足，涉及預(yù)防脫發(fā)、刺激毛發(fā)生長(zhǎng)和毛發(fā)再生的研發(fā)是非常迫切的問(wèn)題。然而，關(guān)于涉及脫發(fā)的研究，自1950年以來(lái)已經(jīng)報(bào)道了涉及發(fā)根和毛發(fā)再生的文獻(xiàn)，但由于缺乏再現(xiàn)性，在過(guò)去的50年中毛發(fā)再生被認(rèn)為是不可能的。

3、干細(xì)胞是由于人體內(nèi)外的環(huán)境和刺激而具有分化成構(gòu)成人體的各種類型細(xì)胞的能力和自我復(fù)制能力的細(xì)胞，存在三種類型已知的干細(xì)胞，例如從早期胚胎中分離的胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)，從胚胎期的原始生殖細(xì)胞中分離的胚胎生殖細(xì)胞(eg細(xì)胞)和從成人骨髓中分離的多潛能成人祖細(xì)胞(mapc細(xì)胞)。現(xiàn)有技術(shù)中，將干細(xì)胞應(yīng)用于毛發(fā)促進(jìn)的研究較少，因此，開(kāi)發(fā)一種安全、有效的干細(xì)胞類毛發(fā)促進(jìn)生長(zhǎng)的產(chǎn)物將具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提出一種用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)干細(xì)胞提取物組合物及其制備方法，能明顯提高干細(xì)胞和外泌體的貯藏穩(wěn)定性，延長(zhǎng)貯藏周期，與提取物混合制備的組合物能明顯促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，促進(jìn)毛囊發(fā)育，誘導(dǎo)和維持小鼠毛發(fā)處于生長(zhǎng)期，且無(wú)激素添加，安全無(wú)刺激，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明提供一種用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)干細(xì)胞提取物組合物的制備方法，向dmem培養(yǎng)基中加入胎牛血清、地塞米松、青霉素、鏈霉素、白細(xì)胞介素-2、磁性復(fù)合顆粒，制備得到培養(yǎng)基，用于體外培養(yǎng)干細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)采用低頻磁場(chǎng)結(jié)合低能量激光培養(yǎng)，制得干細(xì)胞溶液，并從提取液中提取外泌體，與干細(xì)胞混合包埋，制得包埋微球，與從生姜、人參、何首烏提取得到的提取物混合均勻，制得用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)干細(xì)胞提取物組合物。

4、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，包括以下步驟：

5、s1.?培養(yǎng)基的制備：向dmem培養(yǎng)基中加入胎牛血清、地塞米松、青霉素、鏈霉素、白細(xì)胞介素-2、磁性復(fù)合顆粒，制備得到培養(yǎng)基；

6、s2.?干細(xì)胞的體外培養(yǎng)：將切除的臍帶組織用組織保護(hù)液清洗至清除殘留的脂肪、結(jié)蹄組織及血液，用醫(yī)用酒精消毒后，將組織經(jīng)過(guò)消化液消化，離心，棄上清，收集消化后的組織，清洗，加入培養(yǎng)基中，低頻磁場(chǎng)培養(yǎng)后采用低能量激光培養(yǎng)，去除組織貼塊，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80-90%融合后，磁鐵分離磁性物質(zhì)，剩余物離心，收集上清液，固體用d-hank’s液沖洗，消化，重懸于dmem培養(yǎng)基中，凍存，制得干細(xì)胞溶液；

7、s3.?外泌體的提?。簩⒉襟Es2中的上清液采用超高速離心法結(jié)合超濾管法提取外泌體；

8、s4.?中藥提取物的制備：將生姜、人參、何首烏混合粉碎，加熱沸騰提取，重復(fù)提取2-3次，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，干燥，制得提取物；

9、s5.?包埋微球的制備：將步驟s2中的干細(xì)胞溶液復(fù)蘇后，加入步驟s3制得的外泌體，加入海藻酸鈉和乳化劑，攪拌混合均勻，滴加入魚(yú)油中，乳化，滴加氯化鈣溶液，常溫固化，離心，洗滌，干燥，制得包埋微球；

10、s6.?用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)干細(xì)胞提取物組合物的制備：將包埋微球和提取物混合均勻，制得用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)干細(xì)胞提取物組合物。

11、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟s1中所述培養(yǎng)基中胎牛血清的含量為9-11wt%，地塞米松的含量為5-15nmol/l，青霉素的含量為100-120u/ml，鏈霉素的含量為100-120μg/ml，白細(xì)胞介素-2的含量為5-15μg/ml，磁性復(fù)合顆粒的含量為400-500μg/ml；所述磁性復(fù)合顆粒的制備方法如下：

12、t1.?磁性氧化物的制備：將氧化鋯陶瓷粉球磨加入水中，加入氯化鐵和氯化亞鐵，惰性氣體保護(hù)下，加入氨水，加熱攪拌反應(yīng)，離心，洗滌，干燥，煅燒，制得磁性氧化物；

13、t2.?改性：將磁性氧化物加入水中，加入單寧酸和催化劑，加熱攪拌反應(yīng)，磁鐵分離，洗滌，干燥，制得改性磁性氧化物；

14、t3.?負(fù)載：將改性磁性氧化物加入水中，加入nhs和edc，攪拌活化，加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、谷胱甘肽，攪拌反應(yīng)，磁鐵分離，洗滌，干燥，制得磁性復(fù)合顆粒。

15、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟t1中所述球磨的時(shí)間為0.5-1h，所述氧化鋯、氯化鐵和氯化亞鐵的質(zhì)量比為10:3.24:1.26，所述加熱攪拌反應(yīng)的溫度為80-90℃，時(shí)間為3-5h，所述煅燒的溫度為400-600℃，時(shí)間為1-2h；步驟t2中所述磁性氧化物、單寧酸和催化劑的質(zhì)量比為10:2-3:0.1-0.5，所述催化劑為ph=8.5-9.5的tris-hcl溶液，所述加熱攪拌反應(yīng)的溫度為40-50℃，時(shí)間為2-4h。

16、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟t3中所述改性磁性氧化物、nhs、edc、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、谷胱甘肽的質(zhì)量比為12-15:2-3:1.5-2.5:3-4:2-3，所述攪拌活化的時(shí)間為20-40min，所述攪拌反應(yīng)的時(shí)間為10-12h。

17、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟s2中所述消化液為含有1-2wt%胰蛋白酶、0.5-1wt%堿性蛋白酶的ph為7.5-7.7的pbs緩沖液；所述培養(yǎng)的條件為36-38℃，co2濃度為3-6v/v%，所述低頻磁場(chǎng)培養(yǎng)的時(shí)間為5-7d，所述低能量激光培養(yǎng)的時(shí)間為3-5d，所述低頻磁場(chǎng)的頻率為40-50hz，刺激時(shí)間為30-40min/d，所述低能量激光的能量密度為3-7j/cm2，波長(zhǎng)為600-800nm，照射總時(shí)間為3-5min/d，每次照射時(shí)間為30-60s。

18、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟s3中所述超高速離心法結(jié)合超濾管法方法如下：細(xì)胞上清液4℃、500-1000r/min離心10-20min除去細(xì)胞，然后4℃，3000-4000r/min離心15-25min除去細(xì)胞碎片等，超濾管濃縮上清液，4℃，12000-15000r/min離心20-30min除去大囊泡和蛋白，上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾，最后4℃，30000-35000r/min離心50-70min，ph=6.7-7的pbs重懸沉淀，4℃，30000-35000r/min再次離心50-70min，得到的沉淀即外泌體，用ph=6.7-7的pbs重懸，按照bca試劑盒步驟進(jìn)行蛋白定量控制蛋白濃度為80-100mg/l，-80℃冰箱凍存。

19、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟s4中所述生姜、人參、何首烏的質(zhì)量比為7-10:1-2:5-7，所述加熱沸騰提取物的時(shí)間為2-4h。

20、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟s5中所述干細(xì)胞溶液、外泌體、海藻酸鈉的質(zhì)量比為15-30:2-3:7-10。

21、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟s6中所述包埋微球和提取物的質(zhì)量比為12-15:7-10。

22、本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)一種上述的制備方法制得的用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)干細(xì)胞提取物組合物。

23、本發(fā)明具有如下有益效果：

24、本發(fā)明制備了磁性復(fù)合顆粒，以釋放遠(yuǎn)紅外的陶瓷組分氧化鋯陶瓷粉為基體，表面沉積磁性四氧化三鐵，制得磁性氧化物，表面經(jīng)過(guò)單寧酸改性后，在nhs和edc的活化作用下，能夠偶聯(lián)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、谷胱甘肽，這兩種物質(zhì)能明顯協(xié)同促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)促進(jìn)干細(xì)胞具有更活躍的旁分泌功能，大大提高外泌體分泌量，同時(shí)，也能同步促進(jìn)干細(xì)胞的增殖。

25、低頻電磁場(chǎng)可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的某種成分起作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖，可通過(guò)影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜相關(guān)酶來(lái)增加小分子物質(zhì)的滲透能力從而借助第二信使的作用來(lái)改變細(xì)胞行為，同時(shí)，通過(guò)控制電壓門(mén)控鈣通道開(kāi)放，引起鈣離子內(nèi)流，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加；

26、另外，在低頻電磁場(chǎng)的作用下，磁性復(fù)合顆粒能夠有效的與細(xì)胞膜上的蛋白受體如鐵硫聚基化合物結(jié)合，引起離子通道的開(kāi)放，膜張力也發(fā)生改變，從而使細(xì)胞膜發(fā)生去極化和產(chǎn)生動(dòng)作電位，從而促進(jìn)了其負(fù)載的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、谷胱甘肽進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起到調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，鐵硫聚基化合物也具有響應(yīng)磁場(chǎng)的特性，這種性質(zhì)可能會(huì)形成一種類似磁小體，然后通過(guò)對(duì)其進(jìn)行約束或控制，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育功能。

27、另外，低頻電磁場(chǎng)還可以影響干細(xì)胞的分化方向。同時(shí)又有研究表明低頻電磁場(chǎng)促進(jìn)nf-kb的表達(dá)以及mapk信號(hào)通路激活進(jìn)而增強(qiáng)c-mys、cydind1的表達(dá),通過(guò)激活pi3k（磷脂酰肌醇3-激酶）使糖原合酶激酶的活性受到抑制，利于下游基因的轉(zhuǎn)錄，可以影響細(xì)胞內(nèi)wnt信號(hào)通路中的多個(gè)環(huán)節(jié)，從而起到促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

28、另外，本發(fā)明氧化鋯陶瓷粉還能夠釋放遠(yuǎn)紅外波，能夠局部提高細(xì)胞的溫度，從而提高細(xì)胞的活躍度，從而進(jìn)一步提高了細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞分泌大量的高活性外泌體，且細(xì)胞增殖更快。本發(fā)明在低能量激光培養(yǎng)過(guò)程中能夠促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)再生，增強(qiáng)體外細(xì)胞的活性。

29、本發(fā)明將制得的干細(xì)胞和外泌體經(jīng)過(guò)海藻酸鈉包埋，在海藻酸鈉包埋微球中，海藻酸鈉能夠替代水分子與細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)上的親水基團(tuán)形成水合鍵，避免細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變，保持其結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，使得干細(xì)胞能夠保存較長(zhǎng)時(shí)間，提高了其貯藏穩(wěn)定性，也能提高外泌體的貯藏穩(wěn)定性。

30、本發(fā)明制得的用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)干細(xì)胞提取物組合物能明顯提高干細(xì)胞和外泌體的貯藏穩(wěn)定性，延長(zhǎng)貯藏周期，與提取物混合制備的組合物能明顯促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，促進(jìn)毛囊發(fā)育，誘導(dǎo)和維持小鼠毛發(fā)處于生長(zhǎng)期，且無(wú)激素添加，安全無(wú)刺激，具有廣闊的應(yīng)用前景。