本發(fā)明涉及一種kras小分子熒光探針及其制備方法和應用，屬于化學生物學。

背景技術：

1、ras是人類癌癥中最常發(fā)生突變的癌基因，在所有癌癥中約有30％發(fā)生突變。1982年，三家實驗室發(fā)現(xiàn)了首個確認的人類致癌基因ras，并且克隆了三種變體：kras，hras和nras，其中kras是最常突變的致癌基因，出現(xiàn)在大約四分之一的人類腫瘤中。其在肺癌、胰腺癌和結直腸癌中的突變率分別約為30％、90％和40％，并且與預后不良相關。以肺癌為例，85％的kras突變?yōu)間12突變。其中，g12c、g12v、g12d突變分別約占46％、23％、17％(j.med.chem.2020,63(23),14404-14424)。

2、目前對kras?g12c突變型的研究已經(jīng)取得了一定的成果，但人們很快意識到靶向突變kras并不像最初想象的那樣簡單。首先，sotorasib是kras?g12c的特異性抑制劑，而g12c只是眾多kras突變型中的一種。另一種常見的突變，如g12d，在大多數(shù)胰腺腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。相比于研究較多的kars?g12c突變型，對于g12d突變型的研究相對較少。但是g12d在多種腫瘤中突變的頻率也非常高，在胰腺癌，大腸癌，膽道癌中突變頻率分別高達49％，35％，48％，是治療實體瘤的潛在靶點。此外，包括kras、hras和nras的mapk通路具有不同的重復信號和反饋機制，這些機制使人體極易產(chǎn)生對藥物的耐藥性。在臨床試驗中，sotorasib和adagasib的緩解率均不超過30-40％，無進展生存期(pfs)中位數(shù)改善約6個月。對于靶向突變的特異性治療來說，這不是一個理想的數(shù)據(jù)，也不如其他靶向藥物(如egfr和alk抑制劑)觀察到的結果。

3、目前最具代表性的kras?g12d抑制劑為mrtx-1133目前正處于臨床二期研究中。mrtx1133是一種非共價、強效和選擇性kras?g12d抑制劑。它可以阻止sos1催化的核苷酸交換和kras?g12d/gtp/raf1復合物的形成，從而抑制突變體kras依賴性信號轉導。mrtx1133在細胞實驗中具有個位數(shù)納摩爾活性，在含有kras?g12d突變的腫瘤模型中具有顯著的體內療效，并且具有良好的選擇性對g12d的選擇性在野生型的500倍以上(j.med.chem.2021,65(4),3123-3133)。

4、因此開發(fā)體外kras抑制活性測試方法以及高通量篩選方法對其小分子抑制劑的發(fā)展至關重要。準確、穩(wěn)定、可靠的活性測試方法有助于發(fā)現(xiàn)結構新穎的先導化合物，指導先導化合物的結構優(yōu)化以獲得活性更優(yōu)的候選藥物分子，為靶向kras的肺癌、胰腺癌和結直腸癌等疾病的治療藥物的開發(fā)奠定基礎。

5、目前針對kras使用最多的體外靶標活性測試方法為htrf(均相時間分辨熒光)是用來檢測均相體系中待測物的一種最常用的方法，是用來研究藥物靶標的理想的平臺(j.med.chem.2021,65(4),3123-3133)。這種技術結合了熒光共振能量轉移(fret)和時間分辨技術(tr)。在tr-fret實驗中，當供體和受體相離很近時，在供體和受體之間會有熒光共振能量轉移而產(chǎn)生信號。采用雙波長檢測能夠顯著減小緩沖液和培養(yǎng)基的干擾，最終的信號跟產(chǎn)物形成的量成比例。雖然該技術有著靈敏度高，信號穩(wěn)定，可以用于高通量篩選等優(yōu)點，但是其測試體系和操作流程較為復雜，并且測試成本較高。

6、熒光偏振(fp)檢測技術是一種以熒光標記的檢測技術，它把熒光物質標記在特定物質上，使原本微弱的反應信號轉化成較強的熒光信號，起到信號增強的作用。溶液中的大分子(如蛋白質)因體積較大旋轉相對較慢，在被偏振光激發(fā)時發(fā)出偏振光；而小分子的快速旋轉將導致信號消偏。發(fā)射系統(tǒng)使用偏振濾光片分析發(fā)射光的極，偏振水平低表明熒光小分子在樣品中自由移動。偏振水平高表明熒光分子附著在較大的分子復合物上(j.med.chem.2023,66(16),10934-10958)。因此急需突破目前kras抑制活性測試方法的局限性。

技術實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的第一目的是提供一種kras小分子熒光探針。本發(fā)明的第二目的是提供一種該一種kras小分子熒光探針的制備方法。本發(fā)明的第三目的是提供該kras小分子熒光探針作為熒光偏振探針在kras蛋白配體篩選中的應用。

2、技術方案：本發(fā)明所述一種kras小分子熒光探針或其藥學上可接受的鹽或載體，所述kras小分子熒光探針的結構通式如式(i)所示：

3、

4、其中，r1為h或鹵素。

5、進一步地，所述kras小分子熒光探針選自：

6、

7、本發(fā)明所述kras小分子熒光探針或其藥學上可接受的鹽或載體的制備方法，包括以下合成路線：

8、

9、其中，r1為h或鹵素。

10、進一步地，包括以下步驟：

11、(a1)化合物1在有機溶劑中，酸性條件脫保護基得到化合2；

12、(a2)化合物2與化合物3在堿性條件下通過加成反應得到探針；

13、更進一步地，步驟(a1)中，選用的有機溶劑為甲醇或二氧六環(huán)，酸為三氟乙酸或鹽酸。

14、更進一步地，步驟(a1)中，反應的溫度為60-70℃，反應的時間為3-4h。

15、更進一步地，步驟(a2)中，加成反應選用的有機溶劑為甲醇或二氯甲烷，選用的堿為dipea或三乙胺。

16、更進一步地，步驟(a2)中，反應的溫度為20-30℃，反應的時間為1-2h。

17、更進一步地，步驟(a1)中，化合物1的制備按照以下路線合成：

18、

19、其中，r1為h或鹵素。

20、更進一步地，包括以下步驟：

21、(b1)(r)-1-(2,7-二氯-8-氟吡啶并[4,3-d]嘧啶-4-基)-3-甲基哌啶-3-醇、(3r,5s)-5-(羥基甲基)-1-甲基吡咯烷-3-基(3-(1-(2-(((芐氧基)羰基)氨基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4

22、-基)丙基)氨基甲酸酯、碳酸銫、溶于二氧六環(huán)中，氮氣保護下加熱反應，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析分離得中間體；

23、(b2)中間體、碳酸銫、四三苯基磷鈀溶于二氧六環(huán)與水的混合溶劑中，在氮氣保護下加熱反應，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析分離純化得化合物1。

24、更進一步地，步驟(b1)中，加熱反應的溫度為95-105℃，加熱反應的時間為8-10h。

25、更進一步地，步驟(b2)中，加熱反應的溫度為70-80℃，加熱反應的時間為6-8h。

26、本發(fā)明所述kras小分子熒光探針或其藥學上可接受的鹽或載體作為熒光偏振探針在kras蛋白配體篩選中的應用。

27、本發(fā)明還包括一種kras蛋白配體篩選的方法，包括如下步驟：

28、(c1)將本發(fā)明所述的kras小分子熒光探針或其藥學上可接受的鹽或載體、kras蛋白和待測化合物溶于緩沖液，孵育；

29、(c2)利用熒光偏振酶標儀測定混合物在本發(fā)明所述的kras小分子熒光探針或其藥學上可接受的鹽或載體在485nm激發(fā)波長和535nm發(fā)射波長下的偏振值，根據(jù)偏振值確認待測化合物對kras蛋白的親和力。

30、進一步地，緩沖液為pbs緩沖液、tris緩沖液或hepes緩沖液。

31、進一步地，kras蛋白包括但不局限于kras野生型、g12c、g12v、g12d、g12a、g12s、g12r等突變體。

32、本發(fā)明還包括一種試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的kras小分子熒光探針或其藥學上可接受的鹽或載體。

33、為了突破目前kras抑制活性測試方法的局限性，本發(fā)明采用小分子泛抑制劑骨架作為kras蛋白的結合片段，通過進一步引入連接鏈以及熒光基團，設計并合成了一種基于kras抑制劑設計的小分子熒光偏振探針?；谠擃愋》肿訜晒馓结樈晒馄竦幕钚詼y定方法相較于htrf，測試體系簡單，無需復雜的緩沖液體系，受時間、溶劑影響小等優(yōu)勢，可用于包括但不局限于kras野生型以及g12c、g12v、g12d、g12a、g12s、g12r等突變體抑制劑的篩選，基于熒光偏振原理建立了一種穩(wěn)定，快速以及廉價的體外kras蛋白抑制活性檢測方法?；谠擃愋》肿訜晒馄裉结樈⒌幕钚詼y定方法，測試體系簡單，無需復雜的緩沖液體系，受時間、溶劑影響小等優(yōu)勢，同時通過測試已報道的小分子抑制劑bi-2865(nature2023,619,160–166)，驗證了此方法的適用性和準確性?？捎糜趉ras抑制劑的篩選。

34、有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點：

35、本發(fā)明基于該類小分子熒光探針建立熒光偏振的活性測定方法相較于htrf，測試體系簡單：所需蛋白種類少，用量低；無需復雜的緩沖液體系；受時間、溶劑影響小等優(yōu)勢?？捎糜诎ǖ痪窒抻趉ras野生型以及g12c、g12v、g12d、g12a、g12s、g12r等多種突變體抑制劑的篩選，具有良好的應用前景。