本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種基于arih1質(zhì)譜鑒定crl復合物的protac研發(fā)方法。

背景技術：

1、cullin-ring泛素連接酶(crl)家族是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中最大的e3泛素連接酶家族，通過識別特定的底物受體(substrate?receptor)來調(diào)控蛋白質(zhì)的降解。crl家族在多種生物學過程中發(fā)揮關鍵作用，包括細胞周期調(diào)控、信號傳導和癌癥發(fā)生發(fā)展。然而，由于crl家族成員眾多且功能復雜，鑒定其激活狀態(tài)的底物受體一直是研究難點。

2、tmt-ip/ms(tandem?mass?tag免疫沉淀質(zhì)譜)是一種結合了tmt多肽標記技術和免疫沉淀質(zhì)譜聯(lián)用技術的先進方法，廣泛應用于蛋白質(zhì)相互作用研究，尤其在protac(蛋白質(zhì)降解靶向嵌合體)開發(fā)中具有重要應用。tmt(tandem?mass?tag)技術是由美國thermoscientific公司研發(fā)的一種多肽體外標記技術。該技術通過特異性標記多肽的氨基基團，利用同位素標簽在質(zhì)譜分析中實現(xiàn)多肽的定量分析。tmt技術具有高靈敏度、高通量和高準確性的特點，能夠同時對多個樣本進行定量分析，適合復雜蛋白質(zhì)組學研究。ip/ms(免疫沉淀-質(zhì)譜聯(lián)用技術)是一種基于免疫沉淀和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)相互作用研究方法。其原理是利用特異性抗體捕獲目標蛋白及其相互作用蛋白，通過免疫沉淀富集后，再利用質(zhì)譜分析鑒定這些蛋白質(zhì)。tmt-ip/ms結合了tmt的定量能力和ip/ms的蛋白質(zhì)相互作用分析能力。通過tmt標記技術對免疫沉淀后的多肽進行定量分析，能夠更準確地鑒定和定量蛋白質(zhì)相互作用。tmt-ip/ms技術憑借其高特異性、高靈敏度和定量分析能力，在protac開發(fā)中具有重要的應用價值，能夠為靶向蛋白質(zhì)降解研究提供有力支持。

3、在已有的研究中，孫蕾和陳振國團隊通過冷凍電鏡技術揭示了crl3復合物在其催化循環(huán)過程中多個狀態(tài)下的動態(tài)組裝和分子機制。他們研究了crl3kbtbd2復合物的自組裝、底物招募、活化、去活化以及底物受體交換等過程，并解析了其在不同狀態(tài)下的結構。此外，許超教授課題組研究了crl2fem1b復合物的組裝模式及其識別底物的分子機制。這些研究為理解crl家族的功能提供了重要基礎，但主要集中在結構解析和機制研究方面，并且只集中于crl的某一底物上，尚未涉及利用tmt-ip/ms技術進行系統(tǒng)性鑒定激活狀態(tài)的多種底物受體。

4、相比傳統(tǒng)的小分子，protac分子更難開發(fā)，瓶頸主要聚焦在成藥、合成工藝、評價手段等方面。protac在新藥研發(fā)方面的發(fā)展瓶頸包括以下幾點：

5、①分子量較大帶來的成藥性問題：傳統(tǒng)的小分子藥物，基本上都符合成藥性原則——lipinski“類藥五規(guī)則”，但protac分子往往分子量較大，目前報道的protac的分子量大都在700道爾頓以上，因此相比于傳統(tǒng)小分子抑制劑，protac分子的水溶性和細胞滲透性均有限。藥代動力學性質(zhì)差是影響其成藥性的一個主要障礙。

6、②可用的e3泛素連接酶數(shù)量有限：作為protac組成部分之一，e3泛素連接酶起著至關重要的作用。雖然研究已發(fā)現(xiàn)600多種e3連接酶能在人體細胞中發(fā)揮作用，但大部分e3連接酶組織分布具有局限性，即使是目前應用較多的e3連接酶cebn、mdm2、xiap仍有小部分組織尚未覆蓋，如mdm2連接酶，存在于99％測試樣本中，而crbn只在76％的測試樣本中表達。因此組織分布廣泛的e3連接酶及具有良好成藥屬性配體的開發(fā)尚有很大拓展空間。600多種e3連接酶中，僅有12種e3連接酶被應用于protacs中，其中兩種進入臨床試驗階段，另外10種處于臨床前探索階段目前以靶向crbn?e3泛素連接酶為主。

7、③當高濃度的protacs在豐富的e3連接酶和靶標存在下傾向于形成二元復合物而不是三元復合物時，不可避免地會出現(xiàn)hook效應，這給合理設計體內(nèi)劑量帶來了困難。

8、crl(cullin?ring?ubiquitin?ligase)家族，是最大的e3泛素連接酶超家族，包含200多個家族成員，調(diào)控細胞內(nèi)約20％蛋白的泛素化降解。作為最重要的e3超家族，crl的生化活性有一套精準的調(diào)控系統(tǒng)：crl是模塊化的復合體酶，其cullin蛋白作為支架可以組裝上百種不同的底物受體，從而對特異底物蛋白進行泛素化修飾。crl的底物蛋白有包括cyclin?d、hif1α、akt、nrf2、pcna、pd-1、pd-l1等在內(nèi)的關鍵蛋白，因而對細胞周期、信號轉(zhuǎn)導、dna損傷修復、免疫檢查點等生物學過程有重要的調(diào)控作用。多種crl家族成員的表達或活性異常參與了腫瘤等疾病的發(fā)生過程，是重要的治療靶點；另外，例如crl4crbn、crl2vhl也是被廣泛應用于protac技術的e3泛素連接酶，基于crl4crbn的arv-110成功獲批上市表明crl在該新興的新藥研發(fā)領域具有巨大的潛力和空間。盡管crl具有重要的生物學功能，在多種疾病中扮演關鍵的調(diào)控作用，但是相較于催化磷酸化修飾的激酶，針對crl泛素連接酶的小分子藥物開發(fā)遠遠落后。其中主要的原因之一就是關于crl家族的調(diào)控機制和功能的研究相對欠缺。

9、根據(jù)arih1可作為co-e3與發(fā)生擬素化激活的crl(cullin-ring泛素連接酶)形成穩(wěn)定復合物，本發(fā)明主要基于此特點針對arih1進行tmt-ip/ms(tandem?mass?tag免疫沉淀質(zhì)譜)鑒定處于激活狀態(tài)的crl底物受體(substrate?receptor)，篩選鑒定具有關鍵生物學功能的crl家族成員。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術中存在的缺點，而提出的一種基于arih1質(zhì)譜鑒定crl復合物的protac研發(fā)方法。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

3、一種基于arih1質(zhì)譜鑒定crl復合物的protac研發(fā)方法，包括如下步驟：

4、s1：構建pbte-c357s?arih1過表達的h9細胞系；

5、s2：誘導h9干細胞系由esc向中胚層、內(nèi)胚層分化；

6、s3：過表達arih1免疫沉淀實驗；

7、s31：將h9細胞分別接種于12個15cm細胞皿中，加入20ml?rpmi培養(yǎng)基，并同時加入doxycycline誘導flag-arih1過表達，過表達后準備收樣，在收樣當日在對照組加入mln處理；

8、s32：使用使用含有蛋白酶抑制劑的mclb?buffer裂解細胞，在裂解開始前，將蛋白酶抑制劑補充至裂解緩沖液，并將含有蛋白酶抑制劑的裂解液放在冰上，每個皿加入裂解液，刮取細胞并收集到管中，在搖床下旋轉(zhuǎn)處理，然后使用低溫離心機離心；

9、s33：將兩個管的上清液合并為一個樣品，并使用濾器過濾，然后過濾到含有flagbeads的管中，并在搖床上旋轉(zhuǎn)處理；

10、s34：將樣品與flag?beads混合液轉(zhuǎn)移到管中，用mclb?buffer洗滌，使用3×flag肽洗脫，將洗脫液合并至一個ep管內(nèi)；

11、s35：對樣品加入tcep，還原1小時，之后使用碘乙酰胺對樣品進行烷基化；使用tca/乙腈沉淀，然后在buffer中重懸，往重懸液中加入lysc，室溫過夜；

12、s36：次日加入胰蛋白酶，消化6小時，再加入乙腈acn混合，室溫反應；加入tmt，再次進行室溫反應；

13、s37：對分化至中胚層、內(nèi)胚層的細胞采用相同的方式進行處理，之后從每個樣品中取2μl，合并到100μl?5％fa/5％acn中，進行stage?tip處理，干燥后進行質(zhì)譜分析。

14、優(yōu)選的：所述s1中，構建pbte-c357sarih1過表達的h9細胞系具體如下：

15、s11：在轉(zhuǎn)染前一天，將h9細胞接種于6孔板中，加入2ml不含抗生素的培養(yǎng)基，確保細胞在轉(zhuǎn)染時的匯合度達到70％-90％；

16、s12：準備質(zhì)粒dna和轉(zhuǎn)染試劑，計算所需pbte-c357sarih1和hypbase質(zhì)粒的量，按照3:1的比例混合；

17、s13：在無菌離心管中加入100μl無血清的opti-mem培養(yǎng)基，再加入2μg質(zhì)粒dna，混勻，在另一個無菌離心管中加入100μl無血清的opti-mem培養(yǎng)基，再加入5μllipofectamine?2000，混勻后室溫靜置5分鐘，將dna稀釋液加入到lipofectamine?2000稀釋液中，混勻，室溫靜置20分鐘，形成dna-lipofectamine?2000復合物，將制備好的dna-lipofectamine?2000復合物緩慢加入到每個孔的細胞培養(yǎng)基中，晃動培養(yǎng)板，使復合物均勻分布；

18、s14：將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染后，更換為含血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；

19、s15：轉(zhuǎn)染，等待設定時間后進行換液，更換為含血清的完全培養(yǎng)基，并加入潮霉素b進行篩選，待對照細胞死亡80％以上，撤去實驗組的抗生素，并更換為含血清的完全培養(yǎng)基，等待狀態(tài)恢復正常；

20、s16：待穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞可進行正常傳代后，分孔進行wb檢測arih1的表達。

21、優(yōu)選的：所述s14中，具體為：將培養(yǎng)板放入37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染6小時后，更換為含血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。

22、優(yōu)選的：所述s15中，具體為：轉(zhuǎn)染48h后進行換液，更換為含血清的完全培養(yǎng)基，并加入潮霉素b?100μg/ml進行篩選，待對照細胞死亡80％以上，撤去實驗組的抗生素，并更換為含血清的完全培養(yǎng)基，等待狀態(tài)恢復正常。

23、優(yōu)選的：所述s2中，誘導h9干細胞系由esc向中胚層、內(nèi)胚層分化具體如下：

24、s21：當過表達arih1的細胞生長至滿時，將其鋪板；

25、s22：第二天，更換培養(yǎng)液，使用advanced?rpmi?1640培養(yǎng)基，每毫升加入以下試劑：

26、glutamax(100×)：10μl；

27、chir99021(5μm)：1μl；

28、200ng/ml?activin?a：0.2μl；

29、從此時開始，同時加入多西環(huán)素，0.5mg/ml；誘導flag-arih1過表達；

30、s23：第三天，使用s22相同的培養(yǎng)基換液；

31、s24：第四天，此時細胞已分化至中胚層，配置后續(xù)誘導培養(yǎng)基并進行換液；

32、s25：第五天，細胞分化至內(nèi)胚層干細胞。

33、優(yōu)選的：所述s21中，對于6孔板，每孔鋪1×105個細胞，鋪板后，加入y27632，1000:1稀釋，以抑制細胞凋亡。

34、優(yōu)選的：所述s24中，使用advanced?rpmi?1640培養(yǎng)基，每毫升加入以下試劑：

35、glutamax(100×)：10μl；

36、100ng/ml?activin?a：1μl。

37、優(yōu)選的：所述s31中，將h9細胞以2.7×107個細胞的密度分別接種于12個15cm細胞皿中，分為實驗組6個和對照組6個；

38、加入doxycycline的濃度為0.5mg/ml；誘導flag-arih1過表達，過表達48h后準備收樣，在收樣當日在對照組15cm皿加入mln，1μm處理6h；

39、所述s32中，每個皿加入1.6ml裂解液，刮取細胞并收集到管中，在4℃搖床下旋轉(zhuǎn)10分鐘，然后使用4℃低溫離心機1200rpm，離心15分鐘。

40、優(yōu)選的：所述s33中，將兩個管的上清液合并為一個樣品，并使用0.45μm濾器過濾，然后過濾到含有60μl?flag?beads的管中，并在4℃搖床上旋轉(zhuǎn)3小時；

41、所述s34中，將樣品與flag?beads混合液轉(zhuǎn)移到管中，用mclb?buffer洗滌3次，每次15分鐘；接下來使用3×flag肽洗脫，每次200μl，共2次，將洗脫液合并至一個ep管內(nèi)。

42、優(yōu)選的：所述s35中，對樣品加入終濃度為10mm的tcep，在37℃下還原1小時，之后使用終濃度為15mm的碘乙酰胺對樣品進行烷基化；使用tca/乙腈沉淀，然后在50μl?0.2mepps?ph?8.0buffer中重懸，往重懸液中加入1μl?lysc，室溫過夜；

43、所述s36中，加入1μl胰蛋白酶，37℃消化6小時，再加入15μl乙腈acn混合，室溫反應10分鐘；加入4μl?tmt，室溫反應1.5小時。

44、本發(fā)明的有益效果為：

45、1.本發(fā)明基于arih1作為co-e3連接酶與發(fā)生擬素化激活的crl形成穩(wěn)定復合物的特性，利用tmt-ip/ms技術精準鑒定處于激活狀態(tài)的crl底物受體。

46、2.本發(fā)明的技術可應用于不同細胞系，包括多種腫瘤細胞系，有助于系統(tǒng)性地研究crl家族在癌癥發(fā)生發(fā)展中的動態(tài)組裝；通過鑒定具有關鍵生物學功能的crl家族成員，為新型protac的研發(fā)提供具有靶標意義的crl家族成員。

47、3.本發(fā)明的技術能夠快速鑒定關鍵的crl底物受體，為protac的設計提供明確的靶點，從而縮短從靶點發(fā)現(xiàn)到藥物設計的周期；通過精準篩選和鑒定，減少了在無效靶點上的投入，降低了研發(fā)成本。

48、4.本發(fā)明的技術適用于多種細胞系，包括不同的腫瘤細胞系，能夠系統(tǒng)性地研究crl家族在不同癌癥中的動態(tài)組裝和功能調(diào)控；這為開發(fā)針對特定腫瘤類型的個性化protac提供了可能；通過在不同腫瘤細胞系中的應用，可以發(fā)現(xiàn)具有腫瘤特異性的crl底物受體，從而開發(fā)出更精準的腫瘤治療藥物。

49、5.傳統(tǒng)小分子藥物難以靶向“不可成藥”的蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)錄因子和支架蛋白等；本發(fā)明通過tmt-ip/ms技術鑒定的crl底物受體，為開發(fā)針對這些“不可成藥”靶點的protac提供了可能；每個protac分子可以降解多個靶蛋白分子，具有催化降解功能，因此只需低劑量即可發(fā)揮顯著藥效，且藥效持久。