本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥材料，尤其是涉及一種基于dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)構(gòu)建的軟骨類器官及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、骨關(guān)節(jié)炎是一種普遍的退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退化為主要特征，是全球成人主要致殘原因之一。據(jù)統(tǒng)計，全球有超過五億人患有骨關(guān)節(jié)炎，給患者和社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前常用的軟骨修復(fù)策略，包括微骨折、軟骨自體移植術(shù)、軟骨異體移植等，雖在臨床上廣泛應(yīng)用，但均存在一定局限性和不足。例如，微骨折可能導(dǎo)致缺損填充不良和軟骨纖維化；軟骨自體移植術(shù)由于受供體面積限制、有供體移植物不適應(yīng)的問題；軟骨異體移植則存在免疫排斥和感染風(fēng)險，且異體組織與自體軟骨的匹配困難，可能導(dǎo)致生物力學(xué)負(fù)荷不均衡和關(guān)節(jié)承受能力下降。因此，急需新的技術(shù)和手段來解決軟骨修復(fù)的難題。近年來，研究人員在利用生物材料修復(fù)軟骨缺損的研究中開展了大量探索。然而，單純依賴生物材料植入后，通常仍需經(jīng)歷內(nèi)源性細(xì)胞招募、增殖及基質(zhì)分泌等一系列過程，修復(fù)周期較長。類器官是由干細(xì)胞或祖細(xì)胞定向分化而成，具有器官的部分關(guān)鍵特性、結(jié)構(gòu)和功能，并能夠自我更新和自組織。相較于生物材料，軟骨類器官修復(fù)軟骨缺損能夠省略掉內(nèi)源性細(xì)胞招募和增殖的步驟，有望縮短軟骨缺損修復(fù)周期。

2、目前，構(gòu)建軟骨類器官的方法主要包括無支架自組織法和生物材料共培養(yǎng)法。與無支架自組織法相比，生物材料的加入不僅為軟骨類器官提供了類似軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)支架，支持軟骨細(xì)胞的增殖并維持其生理功能，還可以調(diào)控類器官的結(jié)構(gòu)和大小通過設(shè)計生物材料。已有研究表明，修飾過rgd的dna-絲素蛋白雜化水凝膠微球可以負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在14天的軟骨向誘導(dǎo)下成功培養(yǎng)出軟骨類器官前體。然而，14天的誘導(dǎo)不足以支持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的完整合成，難以形成成熟的軟骨類器官。此外，長期的體外培養(yǎng)可能導(dǎo)致軟骨細(xì)胞逐漸發(fā)生去分化，呈現(xiàn)出異常ecm沉積的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，并最終發(fā)展為病理性肥大的狀態(tài)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)構(gòu)建的軟骨類器官及其制備方法與應(yīng)用，所述水凝膠緩釋系統(tǒng)能夠通過長期持續(xù)供給促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨向分化的藥物，更有效地構(gòu)建軟骨類器官。本發(fā)明所述軟骨類器官由dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過數(shù)字光處理系統(tǒng)打印后，在體外培養(yǎng)2-6周制備。

2、本發(fā)明的目的可以具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明第一方面，提供一種dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)，所述dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)是將dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)預(yù)混液經(jīng)過數(shù)字光處理系統(tǒng)打印后的水凝膠系統(tǒng)，

4、其中，dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)預(yù)混液中含有dna、絲素蛋白、丙烯?；痳gd肽、丙烯酰化聚乙二醇nhs酯、氨糖、td-198946及2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸鋰。

5、

6、在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述dna在dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)預(yù)混液中以dna超分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形式存在，所述dna由y型dna單鏈和l型dna單鏈組成，y型dna單鏈共有三條，分別是y1、y2、y3，且y1、y2、y3的摩爾比是1：1：1；l型dna單鏈共有兩條，分別是l1、l2，且l1、l2摩爾比是1：1；y型dna單鏈和l型dna單鏈的摩爾比為1:1～1:2；y1、y2、y3均具有三個粘性末端，l1、l2的兩端各有粘性末端，l型dna單鏈能與y型dna單鏈的粘性末端完全互補(bǔ)。

7、在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，y1、y2、y3、l1、l2的核苷酸序列分別如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5所示。

8、在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)預(yù)混液中，dna的濃度為300,000nm～10,00,000nm，絲素蛋白濃度為5～20wt％，丙烯?；痳gd肽濃度為5～10wt％，丙烯?；垡叶糿hs酯濃度為4.5～10wt％，氨糖濃度為10-20mm，td-198946濃度為100-200nm，2,4,6-三甲基苯甲?；姿徜嚌舛葹?.25-1wt％。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，優(yōu)選地，dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)預(yù)混液中，dna的濃度為500,000nm，絲素蛋白濃度為10wt％，丙烯酰化rgd肽濃度為5wt％，丙烯?；垡叶糿hs酯濃度為4.5wt％，氨糖濃度為10mm，td-198946濃度為100nm，2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸鋰濃度為0.25wt％。

9、本發(fā)明第二方面，提供一種本發(fā)明所述dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)的制備方法，具體步驟包括：

10、步驟1、dna超分子網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：在磷酸緩沖鹽溶液中混合y型dna單鏈和l型dna單鏈，得到dna溶液，通過粘性末端堿基互補(bǔ)配對形成dna超分子的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；

11、步驟2、dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)的制備：

12、預(yù)混液的制備：將甲基丙烯?；z素蛋白、丙烯?；痳gd肽、丙烯?；垡叶糿hs酯、氨糖、td-198946和2,4,6-三甲基苯甲?；姿徜嚺c步驟1中的dna溶液混合，獲得dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)預(yù)混液；

13、水凝膠球體的制備：采用數(shù)字光處理系統(tǒng)技術(shù)，在紫外光照射下形成水凝膠球體，即最終的dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)。

14、在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，步驟1中所述的dna單鏈濃度為300,000nm～10,00,000nm，優(yōu)選為500,000nm。

15、在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，步驟2中所述的溶于dna溶液中的絲素蛋白濃度為5～20wt％，丙烯?；痳gd肽濃度為5-10wt％，丙烯?；垡叶糿hs酯濃度為4.5～10wt％，氨糖濃度為10-20mm，td-198946濃度為100-200nm，2,4,6-三甲基苯甲?；姿徜嚌舛葹?.25-1wt％；優(yōu)選地，絲素蛋白濃度為10wt％，丙烯?；痳gd肽濃度為5wt％，丙烯?；垡叶糿hs酯濃度為4.5wt％，氨糖濃度為10mm，td-198946濃度為100nm，2,4,6-三甲基苯甲?；姿徜嚌舛葹?.25wt％。

16、在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，步驟2中所述的數(shù)字光處理系統(tǒng)技術(shù)，紫外光設(shè)置為365nm波長、4.0～15.0mw?cm-2光強(qiáng)，打印的水凝膠球體的粒徑是500～10000微米。

17、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟2中所述的數(shù)字光處理系統(tǒng)技術(shù)，紫外光設(shè)置為365nm波長、8.0mw?cm-2光強(qiáng)，打印的水凝膠球體的粒徑是2500微米。

18、本發(fā)明第三方面，提供一種基于dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)構(gòu)建的軟骨類器官，所述軟骨類器官由dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過數(shù)字光處理系統(tǒng)打印后，在體外培養(yǎng)2-6周制備，具體步驟包括：

19、步驟1，生物墨水的制備：將dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)預(yù)混液與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以(1～10)×106細(xì)胞/ml的濃度混勻，獲得生物墨水；

20、步驟2，軟骨類器官的制備：采用數(shù)字光處理系統(tǒng)技術(shù)，將生物墨水在紫外光照射下形成3d生物打印球體，3d生物打印球體在體外用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)2-6周，獲得軟骨類器官。

21、進(jìn)一步地，步驟2中所述的數(shù)字光處理系統(tǒng)技術(shù)，紫外光設(shè)置為365nm波長、4.0～15.0mw?cm-2光強(qiáng)，打印的水凝膠球體的粒徑是500-10000微米。

22、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟2中水凝膠球體在體外用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)4周。

23、本發(fā)明第四方面，提供一種本發(fā)明所述的基于dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)構(gòu)建的軟骨類器官的應(yīng)用，選自以下應(yīng)用中的一種：

24、(1)用于制備軟骨組織修復(fù)材料；

25、(2)用于藥物篩選；

26、(3)用于疾病模型構(gòu)建。

27、本發(fā)明第五方面，提供一種本發(fā)明所述的dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)的應(yīng)用，選自以下應(yīng)用中的一種：

28、(1)細(xì)胞培養(yǎng)；

29、(2)組織結(jié)構(gòu)的構(gòu)建；

30、(3)類器官構(gòu)建。

31、賦予dna-絲素蛋白雜化水凝膠可持續(xù)提供促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨向分化、促軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成效率且防止骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在長期分化過程中發(fā)生去分化和肥大化的功能，有望實(shí)現(xiàn)長期培養(yǎng)、成熟軟骨類器官的構(gòu)建。

32、本技術(shù)方案就是基于以上發(fā)明構(gòu)思而提出的。

33、氨糖是軟骨基質(zhì)的組成部分，是合成糖胺聚糖(如透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素)和蛋白多糖的前體。不僅可以刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生成更接近于天然軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)，還能維持軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定。在三維培養(yǎng)體系中，隨著細(xì)胞的增殖和基質(zhì)的改變，局部的機(jī)械張力會促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生去分化和肥大化。

34、td-198946，是一種噻吩并唑衍生物，是一種高效的軟骨誘導(dǎo)劑。相較于其他的軟骨誘導(dǎo)劑而言，td-198946不僅可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的透明軟骨向分化還會抑制其肥大化和去分化。然而，簡單的藥物包載在水凝膠中容易引發(fā)突釋問題。將藥物化學(xué)接枝到水凝膠中是避免突釋的常用策略。目前常用的藥物化學(xué)接枝方法包括共價接枝、分子印跡、自組裝和點(diǎn)擊化學(xué)法。相比其他方法，共價接枝具有更高的穩(wěn)定性、靶向性和可控藥物釋放性。

35、丙烯?；垡叶糿hs酯是一種雙功能酯化反應(yīng)的共價交聯(lián)劑。其nhs酯官能團(tuán)可與氨糖和td-198946上的氨基反應(yīng)，其另一端的丙烯酸酯基團(tuán)則可與silma反應(yīng)。因此，借助丙烯?；垡叶糿hs酯可實(shí)現(xiàn)氨糖和td-198946與絲素蛋白水凝膠網(wǎng)絡(luò)的共價接枝。因此通過丙烯?；垡叶糿hs酯將氨糖和td-198946共價錨定于dna-絲素蛋白雜化水凝膠，可實(shí)現(xiàn)持續(xù)養(yǎng)分供給，用于軟骨類器官的長期培養(yǎng)。

36、本發(fā)明方案，dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)中dna網(wǎng)絡(luò)由單鏈dna通過堿基互補(bǔ)配對形成，本發(fā)明所述dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)由dna-絲素蛋白雜化水凝膠為主要體系，通過丙烯?；垡叶糿hs酯將兩種藥物(氨糖和td-198946)共價錨定于絲素蛋白水凝膠網(wǎng)絡(luò)上。該體系中氨糖的引入可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成，td-198946的引入可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨向分化，丙烯酰化rgd肽可以提供細(xì)胞的黏附位點(diǎn)，所述水凝膠緩釋系統(tǒng)能夠通過持續(xù)釋放長期支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨向分化的藥物，實(shí)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在該體系中的長期培養(yǎng)。利用此體系在體外與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)2到6周可制備出可以高效修復(fù)軟骨缺損的軟骨類器官，為修復(fù)軟骨缺損提供新的治療策略。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下效果：

38、其一，本發(fā)明中所述的dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)中的丙烯?；垡叶糿hs酯的nhs酯官能團(tuán)可與氨糖和td-198946上的氨基反應(yīng)，其另一端的丙烯酸酯基團(tuán)則可與silma反應(yīng)，將氨糖和td-198946共價錨定于dna-絲素蛋白雜化水凝膠，可實(shí)現(xiàn)持續(xù)養(yǎng)分供給；

39、其二，本發(fā)明中所述的dna-絲素蛋白雜化水凝膠緩釋系統(tǒng)中引入的氨糖和td-198946可以顯著提升促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨向分化效率；

40、其三，本發(fā)明能夠作為軟骨移植物移植到軟骨缺損處促進(jìn)軟骨再生修復(fù)。