本發(fā)明涉及生物工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶突變菌株及其構(gòu)建方法以及在核苷生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、核苷是一類糖苷的總稱。核苷是核酸和核苷酸的組成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脫氧核糖與嘧啶堿或嘌呤堿縮合而成。核苷一般為無(wú)色結(jié)晶，不溶于普通有機(jī)溶劑，易溶于熱水，熔點(diǎn)為160～240℃。由d-核糖生成的核苷稱核糖核苷，參與rna組成，由d-α-脫氧核糖生成的核苷稱脫氧核糖核苷，參與dna組成。d-核糖與腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶縮合生成相應(yīng)的腺嘌呤核糖核苷、鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它們分別簡(jiǎn)稱為腺苷(a)、鳥(niǎo)苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。

2、鳥(niǎo)嘌呤核苷(鳥(niǎo)苷)和次黃嘌呤核苷(肌苷)在食品和醫(yī)藥行業(yè)有著廣泛的作用。在食品領(lǐng)域，鳥(niǎo)苷和肌苷分別是鳥(niǎo)苷酸二鈉和肌苷酸二鈉的重要前體，而鳥(niǎo)苷酸二鈉與肌苷酸二鈉組合使用作為食品增鮮劑，廣泛應(yīng)用于雞精、醬油等調(diào)味品中。在醫(yī)藥領(lǐng)域，鳥(niǎo)苷和肌苷可以作為多種抗病毒藥物的醫(yī)藥中間體，如無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷、三氮唑核苷、三磷酸鳥(niǎo)苷鈉等都需要鳥(niǎo)苷作為合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前體，而肌苷酸可以作為合成腺苷酸(amp)和鳥(niǎo)苷酸(gmp)的前體，適用于各種原因引起的白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、各種心臟疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外還可治療中心視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等。

3、腺苷即腺嘌呤核苷，化學(xué)名為6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氫嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脫磷酸后的產(chǎn)物，屬于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷，可直接進(jìn)入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時(shí)還參與擴(kuò)張冠脈血管，增加血流量。腺苷對(duì)心血管系統(tǒng)和肌體的許多其它系統(tǒng)及組織均有生理作用。腺苷除了可以用作治療心臟的特效藥物之外，還是用于合成三磷酸腺苷(atp)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥等行業(yè)。

4、目前，微生物發(fā)酵是生產(chǎn)核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或短小芽孢桿菌等。在生長(zhǎng)菌株的選育與改造過(guò)程中，通過(guò)使用紫外誘變、硫酸二乙酯誘變育種，定向選育核苷高產(chǎn)菌株；或者根據(jù)細(xì)菌中核苷酸的代謝路徑和調(diào)節(jié)機(jī)理，深入了解菌株遺傳背景及菌株特性，通過(guò)代謝工程手段，有目的性地對(duì)菌株進(jìn)行改造，以獲得性狀優(yōu)良、能夠高產(chǎn)核苷的生產(chǎn)菌株。但目前核苷菌種的發(fā)酵性能仍較差、核苷的轉(zhuǎn)化率仍較低，不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶突變菌株及其構(gòu)建方法以及在核苷生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種修飾的微生物，所述微生物相比于未修飾的微生物，其肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶(由yrhl基因編碼)的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強(qiáng)的核苷生產(chǎn)能力。

3、本發(fā)明中，所述肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶在ncbi上的參考序列編號(hào)為cab14656.1。

4、進(jìn)一步地，微生物中的肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的活性降低或喪失是由選自以下1)-3)，或任選的組合實(shí)現(xiàn)的：

5、1)通過(guò)改變所述肽聚糖-o-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列而降低或喪失；

6、2)通過(guò)改變編碼所述肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列而降低或喪失；

7、3)通過(guò)敲除所述肽聚糖-o-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的編碼序列而喪失。

8、進(jìn)一步地，采用誘變、定點(diǎn)突變或同源重組的方法來(lái)降低所述肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因的表達(dá)或敲除所述肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因。

9、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶活性降低或喪失是通過(guò)如下a、b或c來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

10、a、將編碼肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶第575位氨基酸的密碼子由tgg或ctt突變?yōu)閠ga、tag或taa；

11、b、將肽聚糖-o-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因的起始密碼子由atg突變?yōu)閠tg；

12、c、敲除編碼肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的orf框。

13、所述微生物可以是枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(bacillus?pumilus)或大腸桿菌(escherichia?coli)等。例如，出發(fā)菌株為b.subtilis?168、b.subtilis?a5(參見(jiàn)cn110257315b)、b.s?833、b.a?836(參見(jiàn)cn112574934a)。

14、第二方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)核苷菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，失活或弱化微生物中的肽聚糖-o-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因。

15、所述弱化選自以下a)-c)，或任選的組合實(shí)現(xiàn)的：

16、a)通過(guò)改變所述肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列而降低或喪失；

17、b)通過(guò)改變編碼所述肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列而降低或喪失；

18、c)通過(guò)敲除所述肽聚糖-o-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的編碼序列而喪失。

19、弱化的方法可選自誘變、定點(diǎn)突變、同源重組等中的至少一種。

20、優(yōu)選地，弱化是通過(guò)如下①、②或③實(shí)現(xiàn)的：

21、①將編碼肽聚糖-o-乙酰基轉(zhuǎn)移酶第575位氨基酸的密碼子由tgg或ctt突變?yōu)閠ga、tag或taa；

22、②將肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因的起始密碼子由atg突變?yōu)閠tg；

23、③敲除編碼肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶的orf框。

24、第三方面，本發(fā)明提供按照所述方法構(gòu)建得到的肽聚糖-o-乙酰基轉(zhuǎn)移酶突變菌株。

25、第四方面，本發(fā)明提供所述微生物或按照所述方法構(gòu)建得到的肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶突變菌株在核苷或核苷衍生物發(fā)酵生產(chǎn)或提高核苷或核苷衍生物發(fā)酵產(chǎn)量中的應(yīng)用。

26、本發(fā)明所述核苷衍生物包括但不限于：

27、①腺苷，及腺苷相關(guān)衍生物，如三磷酸腺苷(atp)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷等；

28、②肌苷，及肌苷相關(guān)衍生物，如肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸、腺苷酸等；

29、③鳥(niǎo)苷，及鳥(niǎo)苷相關(guān)衍生物，如鳥(niǎo)嘌呤、鳥(niǎo)苷酸、核黃素、二乙酰鳥(niǎo)苷酸等。

30、第五方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)核苷的方法，所述方法包括如下步驟：

31、i)培養(yǎng)所述微生物或按照所述方法構(gòu)建得到的肽聚糖-o-乙?；D(zhuǎn)移酶突變菌株，獲得培養(yǎng)物；

32、ii)從步驟i)中獲得的所述培養(yǎng)物中收集所產(chǎn)生的核苷。

33、借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

34、本發(fā)明分別以解淀粉芽孢桿菌b.s?833和b.a?836(其具有一定的鳥(niǎo)苷或肌苷生產(chǎn)能力)為出發(fā)菌株構(gòu)建了yrhl基因弱化菌株，弱化的方式為對(duì)yrhl基因進(jìn)行點(diǎn)突變，和/或?qū)⑵湔麄€(gè)orf框完全敲除。構(gòu)建獲得的菌株產(chǎn)核苷能力均有不同程度的提升。同時(shí)，本發(fā)明以枯草芽孢桿菌b.subtilis?a5(其具有一定的腺苷或肌苷生產(chǎn)能力)為出發(fā)菌株構(gòu)建了yrhl的突變和/或?qū)⑵湔麄€(gè)orf框完全敲除菌株，構(gòu)建獲得的工程菌株其產(chǎn)肌苷或腺苷能力有一定提升。

35、上述改造可應(yīng)用于解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，但不限于上述兩種菌株，也可將其應(yīng)用于如短小芽孢桿菌、大腸桿菌等宿主菌，用于產(chǎn)肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷等核苷或?qū)?yīng)的核苷衍生物，如次黃嘌呤、肌苷酸、鳥(niǎo)嘌呤、鳥(niǎo)苷酸、核黃素、二乙酰鳥(niǎo)苷酸等。