本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種ala衍生物及制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥是人類健康的主要威脅，傳統(tǒng)的癌癥治療方法具有副作用大，風(fēng)險(xiǎn)高的缺點(diǎn)，因此開發(fā)有效的癌癥治療方法刻不容緩。光動(dòng)力療法(photodynamic?therapy,pdt)是一種人類癌癥的常用治療方法，具有微創(chuàng)、副作用低等優(yōu)點(diǎn)。光敏劑在pdt中起著重要作用。光敏劑在有氧的環(huán)境中暴露在光照下后會(huì)產(chǎn)生活性氧(ross)，ross會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞或組織產(chǎn)生氧化損傷。迄今為止，研究者已經(jīng)設(shè)計(jì)和合成了許多用于pdt的光敏劑。然而，只有少數(shù)光敏劑被批準(zhǔn)用于臨床。其中，5-氨基乙酰丙酸(ala)受到了廣泛的關(guān)注。不同于其它光敏劑，ala本身沒有光敏性，但可以通過細(xì)胞內(nèi)血紅素生物合成途徑轉(zhuǎn)化為光敏劑卟啉(ppⅸ)。與其他光敏劑相比，ala具有快速清除、低皮膚光敏性和低全身毒性等優(yōu)點(diǎn)。在生理?xiàng)l件下，ala是一種兩性離子，親水性強(qiáng)，不能有效地穿透細(xì)胞膜等生物屏障，因此提高ala的親脂性是提高其細(xì)胞穿透性的最有效途徑，而ala的酯化是提高親脂性的一種常見方法，其中最具代表性的是ala-ome(metvix)和ala-ohex(cysview)。目前，metvix已被廣泛應(yīng)用于光化性角化病和基底細(xì)胞癌的治療，而cysview被批準(zhǔn)用于膀胱癌的光檢測(cè)。然而，ala及其酯類衍生物在生理?xiàng)l件下仍然存在不穩(wěn)定性的缺點(diǎn)。這主要是由于5-氨基基團(tuán)的高親核性，ala及其酯類衍生物在生理?xiàng)l件下均易形成希夫氏堿二聚體。因此，對(duì)ala氨基端進(jìn)行修飾可以防止二聚，提高ala的穩(wěn)定性。

2、此外，幾乎所有光敏劑都缺乏腫瘤特異性，包括ala及其衍生物。研究者們已經(jīng)提出了各種方法來解決這一問題，主要可歸納為兩個(gè)方面：(1)利用腫瘤特異性配體靶向輸送光敏劑；(2)利用腫瘤微環(huán)境激活光敏劑。近幾十年來，已設(shè)計(jì)出多種連接有腫瘤特異性配體(如維生素、多肽和核苷)的ala酯類衍生物以提高對(duì)腫瘤的選擇性。然而，這些腫瘤靶向的ala酯類衍生物在生理?xiàng)l件下仍然不穩(wěn)定。與此同時(shí)，研究者們又開發(fā)了腫瘤微環(huán)境可激活的ala衍生物。不同于ala酯類衍生物，這些應(yīng)激響應(yīng)的ala衍生物的合成主要是通過一個(gè)易被腫瘤相關(guān)刺激因子(如組織蛋白酶e、β-葡萄糖醛酸酶和腫瘤高表達(dá)氨基肽酶)激活的基團(tuán)來修飾ala中的5-氨基。與ala及其酯類衍生物相比，這些n-修飾的衍生物在生理?xiàng)l件下非常穩(wěn)定。ala的有效釋放對(duì)于n-修飾的ala前藥實(shí)現(xiàn)其藥理活性是必不可少的。近來，研究者們還開發(fā)了雙靶向策略，既包含有提高腫瘤選擇性攝取的靶向配體，還包含可被腫瘤微環(huán)境激活的響應(yīng)因子，進(jìn)一步提高了光敏劑的腫瘤靶向性。

3、綜上所述，采用各種策略對(duì)ala進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾來解決ala的脂溶性、穩(wěn)定性和選擇性問題是重要的研究方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)上述問題提出一種ala衍生物及制備方法及應(yīng)用，其構(gòu)思在于通過天然氨基酸修飾改善ala的理化性質(zhì)，提高在腫瘤細(xì)胞中的攝取和積累，且提高ala衍生物在酸性、中性和堿性條件下的穩(wěn)定性。

2、第一方面，本發(fā)明提出一種ala衍生物，其結(jié)構(gòu)式如下：

3、

4、其中r1為羥基、甲氧基或正己氧基中的一種；

5、r2為l-丙氨酸、l-賴氨酸或l-瓜氨酸中的一種；

6、r3為l-纈氨酸、l-苯丙氨酸、l-賴氨酸或中的一種；

7、r4為乙酰基、芐氧羰基、乙胺基或中的一種。(優(yōu)選為乙胺基)

8、更具體的，上述的ala衍生物的結(jié)構(gòu)式為下列之一：

9、

10、

11、

12、第二方面，本發(fā)明提出上述的ala衍生物的制備方法，其步驟包括：

13、步驟1：將式1所示原料與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)溶于有機(jī)溶劑中，于0℃下攪拌，然后加入1,3-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)，于0℃下攪拌均勻(優(yōu)選1h)，隨后移至室溫下繼續(xù)攪拌16-24h，通過tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；所述式1所示原料、nhs與dcc的物質(zhì)的量之比為1:1～2:1～2；

14、反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，得濾液；減壓濃縮濾液，將濃縮產(chǎn)物使用dcm復(fù)溶，于-20℃環(huán)境下放置12h，再次抽濾得濾液，減壓濃縮濾液，得式2所示化合物粗產(chǎn)物；

15、步驟2：將步驟1制得的式2化合物粗產(chǎn)物與式3所示化合物溶于有機(jī)溶劑中，隨后加入堿性化合物的水溶液，于0℃下攪拌均勻(優(yōu)選1h)，再于室溫下攪拌16-24h，通過tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；所述式1所示原料、所述式3所示化合物、所述堿性化合物的物質(zhì)的量之比為1:1～1.2:1～2；

16、反應(yīng)結(jié)束后，加入飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，使用乙酸乙酯洗滌反應(yīng)液，于0℃下用10％稀鹽酸調(diào)節(jié)水相的ph至2～3(優(yōu)選用10％稀鹽酸)，抽濾得濾餅，于0℃下用10％稀鹽酸洗滌濾餅，真空干燥濾餅，得到式4所示化合物；

17、步驟3：將式4所示化合物與1-羥基苯并三氮唑(hobt)溶于有機(jī)溶劑中，再加入堿性化合物，于0℃下攪拌，隨后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edci)，于0℃下攪拌均勻(優(yōu)選1h)，加入式5所示化合物，再于室溫下反應(yīng)2～4h，通過薄層色譜(tlc)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；所述式4所示化合物、hobt、堿性化合物、edci、式5所示化合物的物質(zhì)的量之比為1:1～1.2:1～2:1～1.5:1～2；

18、反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮步驟3得到的反應(yīng)液，用乙酸乙酯復(fù)溶濃縮產(chǎn)物，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化銨水溶液、飽和食鹽水洗滌；有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，柱層析分離純化，干燥，得到式6所示化合物；

19、步驟4-1：將式6所示化合物溶于thf中，加入1mol/l的氫氧化鋰水溶液，于室溫下攪拌2-4h，通過薄層色譜(tlc)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；所述式6所示化合物與氫氧化鋰的物質(zhì)的量之比為1:1～5；

20、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟4-1得到的反應(yīng)液中加入陽離子交換樹脂，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的ph至6～7，然后濾除陽離子交換樹脂，減壓濃縮濾液，加入無水乙酸乙酯打漿，抽濾得濾餅，真空干燥濾餅，得到式7所示的化合物；

21、步驟5-1：將式7所示化合物溶于有機(jī)溶劑中，加入酸性溶液，所述酸性溶液為hcl-ea溶液、tfa、msoh、tsoh中的一種或多種，所述式7所示化合物與酸性溶液中酸性組分的物質(zhì)的量之比為1:1.2～10；將所得混合溶液于25-35℃下攪拌2-5h，通過tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮反應(yīng)液，加入乙醚充分研磨攪拌，離心，除去上層清液，再次加入乙醚，充分研磨攪拌，離心，除去上層清液，收集下層固體，真空干燥，得到成品，即式ⅰ所示化合物。

22、本發(fā)明另提出一種上述制備方法的變體，其特征在于，完成步驟3后，步驟4-1至步驟5-1的操作由銜接步驟4-2與步驟5-2替代：

23、所述的操作如下：

24、步驟4-2：將式6所示化合物溶于有機(jī)溶劑中，加入酸性溶液，所述酸性溶液為hcl-ea溶液、tfa、msoh、tsoh中的一種或多種，所述式6所示化合物與酸性溶液中酸性組分的物質(zhì)的量之比為1:1.2～10；將所得混合溶液于25-35℃下攪拌2-5h，通過tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮反應(yīng)液，加入乙醚充分研磨攪拌，離心，除去上層清液，再次加入乙醚，充分研磨攪拌，離心，除去上層清液，收集下層固體，真空干燥，直接得到成品，即式ⅰ所示化合物。

25、本發(fā)明另提出一種上述制備方法的變體，其特征在于，完成步驟3后，步驟4-1至步驟5-1的操作由銜接步驟4-3與步驟5-2替代：

26、步驟4-3：將式6所示化合物溶于乙酸乙酯中，加入hcl-ea溶液，所述式6所示化合物與hcl-ea溶液中hcl的物質(zhì)的量之比為1:1.2～10；將所得混合溶液于25-35℃下攪拌2-5h，通過tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮反應(yīng)液，加入乙醚充分研磨攪拌，離心，除去上層清液，再次加入乙醚，充分研磨攪拌，離心，除去上層清液，收集下層固體，真空干燥，得到式8所示化合物；

27、步驟5-2：將式8所示化合物與生物素-n-琥珀酰亞胺基酯溶于有機(jī)溶劑中，緩慢加入堿性化合物，于室溫下攪拌24h，通過tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；所述堿性化合物為dipea、三乙胺、碳酸氫鈉中的一種或多種；所述式8所示化合物、生物素-n-琥珀酰亞胺基酯與堿性物質(zhì)的物質(zhì)的量之比為1:1.2～1.5:1.2～1.5；反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮反應(yīng)液，加水析出固體，抽濾，將濾渣重新分散在水中，加熱重結(jié)晶，抽濾，真空干燥濾餅，得到式ⅰ所示化合物。

28、作為優(yōu)選，步驟1中所述有機(jī)溶劑為dcm、thf、乙腈、甲醇或dmf中的一種或多種；有機(jī)溶劑與式1所示原料的體積摩爾之比為4～10:1ml/mmol。

29、作為優(yōu)選，步驟2中所述有機(jī)溶劑為thf、dcm、乙腈、乙二醇二甲醚(dme)中的一種或多種；步驟2中有機(jī)溶劑的用量以式2所示化合物的物質(zhì)的量計(jì)為4～10:1ml/mmol；所述堿性化合物為碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、dipea中的一種或多種；堿性化合物的水溶液與有機(jī)溶劑的體積之比為1:1～1.5。

30、作為優(yōu)選，步驟3中所述有機(jī)溶劑為thf、dcm、dmf、乙腈中的一種或多種；步驟3中有機(jī)溶劑用量以式4所示化合物物質(zhì)的量計(jì)為4～10:1ml/mmol；所述堿性化合物為dipea、nmm、nmi、三乙胺、吡啶、2,6-二甲基吡啶中的一種或多種。

31、作為優(yōu)選，驟4-1中所述氫氧化鋰水溶液與thf的體積之比為1:1～3；步驟5-1中所述有機(jī)溶劑為dcm、ea、thf、六氟異丙醇(hfip)中的一種或多種；有機(jī)溶劑的用量以式7所示化合物物質(zhì)的量計(jì)為4～10:1ml/mmol。

32、第三方面，本發(fā)明提出一種ala衍生物及其在藥學(xué)上可接受的鹽在治療惡性腫瘤和皮膚病中的應(yīng)用。

33、所述惡性腫瘤或皮膚病為基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、日光性角化病、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、尖銳濕疣、銀屑病和鮑恩病。

34、本發(fā)明的有益效果在于：

35、本發(fā)明式ⅰ所示的ala衍生物是具有被腫瘤微環(huán)境選擇性激活能力和/或被腫瘤細(xì)胞選擇性攝取的光動(dòng)力治療化合物，這些化合物的結(jié)構(gòu)至少包含以下三個(gè)部分中的兩個(gè)，且必定包含ala部分：(1)ala或其酯類衍生物(如ala甲酯和ala己酯),該部分可通過細(xì)胞內(nèi)血紅素生物合成途徑轉(zhuǎn)化為光敏劑原卟啉(ppⅸ)；(2)生物素，用于改善分子對(duì)腫瘤的靶向性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞或組織的選擇性攝??；(3)短肽部分，包括天然氨基酸和組織蛋白酶b(cathepsin?b，cath?b)響應(yīng)二肽(擬肽)接頭，修飾ala或其衍生物的5-氨基端，天然氨基酸修飾可改善ala的理化性質(zhì)，提高在腫瘤細(xì)胞中的攝取和積累，cath?b響應(yīng)二肽(擬肽)接頭可被腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的cath?b識(shí)別并選擇性切割，釋放出ala或其酯類衍生物；這些化合物在酸性、中性和堿性條件下均具有較高的穩(wěn)定性。

36、體外實(shí)驗(yàn)表明，與母體化合物ala或其衍生物(如ala-ome)相比，式ⅰ所示的ala衍生物親脂性和穩(wěn)定性的提升使其在三陰性乳腺癌細(xì)胞中能夠更有效地產(chǎn)生ppⅸ，同時(shí)，ppⅸ生成的量與腫瘤細(xì)胞中cath?b水平的過表達(dá)呈正相關(guān)。更重要的是，該化合物的生物素部分顯著提高了化合物的光毒性，這可能歸因于生物素對(duì)腫瘤的靶向作用，提高了ala在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的富集程度，產(chǎn)生了更強(qiáng)的光動(dòng)力效應(yīng)。總之，腫瘤微環(huán)境選擇性激活和生物素選擇性攝取作用的雙靶向策略顯著提高了基于ala的pdt的抗腫瘤效果。

37、因此，本發(fā)明式ⅰ所示的ala衍生物，及其藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽、立體化學(xué)異構(gòu)體形式，可用治療高cath?b表達(dá)水平的腫瘤。