本發(fā)明屬于真菌檢測，尤其涉及一種集成edna和qpcr技術的植物病原真菌監(jiān)測方法及應用。

背景技術：

1、環(huán)境dna(environmental?dna，edna)是指從水環(huán)境、土壤、沉積物等環(huán)境樣本中提取dna，宏條形碼技術對基因組的特定dna片段進行pcr擴增和全基因組測序，通過將edna序列與已知的分類學名稱相關聯，研究人員可以識別出樣本中存在的多種生物種類，以進一步對環(huán)境樣品中多個生物群落進行監(jiān)測的技術。

2、當前幾乎所有防止外來物種入侵、保護生物多樣性的措施主要依賴于物種監(jiān)測，早期發(fā)現和快速監(jiān)測對于控制和清除外來入侵物種具有十分重要的意義。監(jiān)測是早期發(fā)現的基礎，通過確定自然生態(tài)系統(tǒng)中已有種群的位置和大小，并在外來入侵物種尚未具有規(guī)模前有效識別，從而防止物種進入生態(tài)系統(tǒng)。因此，早期監(jiān)測外來入侵物種的多樣性一直被認為是減少外來入侵物種影響的重要策略。但由于入侵初期種群數量較少，傳統(tǒng)監(jiān)測方法耗時長且效率低，難以及時發(fā)現。此外，傳統(tǒng)監(jiān)測技術仍然存在一些問題，如分類學專業(yè)知識降低，采樣不標準化等。

3、相對于傳統(tǒng)監(jiān)測方法，環(huán)境dna(edna)宏條形碼技術是一種新興的生物監(jiān)測方法，在有害生物識別領域應用較廣。如利用edna技術監(jiān)測技術發(fā)現了農業(yè)害蟲茶翅蝽(halyomorpha?halys)和小麻臭蟻(linepithema?humile)。

4、基本步驟：收集各種環(huán)境樣本(如海水、淡水、土壤或空氣)并提取dna，利用高通量測序平臺對dna序列測序并分析，快速識別和監(jiān)測生物多樣性。該技術結合了高通量測序(hts)平臺的優(yōu)勢，能夠快速且非侵入性地調查生態(tài)系統(tǒng)的物種豐富度，同時還具有采樣簡單、高效，靈敏度高等優(yōu)勢，對物種的監(jiān)測具有更高的檢出率，可以更好的監(jiān)測物種、減小對環(huán)境和生物物種的破壞。由于edna技術缺乏完整的分子數據庫，edna宏條形碼技術只能作為初步篩查，但無法明顯檢測。

5、edna技術能夠補充傳統(tǒng)方法的不足，可以在早期及時了解環(huán)境物種組成識別入侵物種，從而使人們能夠及時采取措施防止入侵物種的傳播。

6、中國專利202110675797.5的說明書中記載了一種基于環(huán)境dna宏條形碼監(jiān)測數據，對淡水生態(tài)系統(tǒng)的浮游植物進行生物完整性評價的方法，基于環(huán)境dna宏條形碼監(jiān)測浮游植物的結果，設計了包含(1)參考點和受損點確定；(2)環(huán)境dna樣品采集；(3)edna宏條形碼生物監(jiān)測；(4)基于edna宏條形碼監(jiān)測的候選生物指標定義及計算；(5)候選指數篩選；(6)選定生物指標計算浮游植物生物完整性得分；(7)劃分健康等級等一系列監(jiān)測與評價流程，為淡水浮游植物的生態(tài)完整性評價提供了完整且易于操作的指導，可廣泛應用于溪流、河流、湖泊和水庫等淡水生態(tài)系統(tǒng)的浮游植物完整性評價和水生態(tài)健康狀況評估。但到目前為止全球范圍內的edna方法，包括該專利中主要是應用于各種海洋生態(tài)系統(tǒng)研究，對于生物多樣性監(jiān)測、物種檢測和鑒定、生物監(jiān)測的研究相對較少。

7、隨著擴增子高通量測序技術的迅速發(fā)展，環(huán)境樣品中的真菌多樣性越來越被關注。edna技術可對環(huán)境中大部分物種進行檢測篩查，但易受檢測靶標在總體樣品中的豐度影響，且由于片段較短準確度相對較低。因此，迫切需要一種替代的、高效的大規(guī)模生物多樣性監(jiān)測技術用于進行大規(guī)模的生物多樣性調查和監(jiān)測瀕危物種等。

技術實現思路

1、為了解決以上技術問題，本發(fā)明提供一種基于edna及qpcr技術監(jiān)測植物病原真菌的引物對、探針及方法及應用，通過特定的引物對和探針，結合edna宏條形碼技術方法，能夠高效、準確地從環(huán)境樣品中檢測和識別植物病原真菌，實現了檢疫物種的初篩到精準鑒定，還可定量檢測出其初始dna濃度，為環(huán)境監(jiān)測和植物病害防控提供了一種新的方法和重要流程，可快速響應植物病害的發(fā)生，及時采取措施，減少農業(yè)生產損失，保護生態(tài)環(huán)境。

2、解決以上技術問題的本發(fā)明中的一種基于edna及qpcr技術監(jiān)測植物病原真菌的引物對，其正向引物its9munngs核苷酸序列如seq?id?no.1所示，反向引物its4ngsuni核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3、具體的，使用真菌特異性引物對為its9munngs核苷酸序列為5′-tacacaccgcccgtc-3′(seq?id?no.1)，its4ngsuni核苷酸序列為5′-cctscscttantdatatgc-3′(seq?id?no.2)。

4、本發(fā)明中引物對用于宏條形碼擴增，為真菌特異性的引物。

5、本發(fā)明中一種集成edna和qpcr技術的植物病原真菌監(jiān)測方法，包括以下步驟：

6、(1)樣品采集：采集空氣、水、土壤等環(huán)境樣品進行分析；

7、(2)樣品dna提取：

8、針對不同的樣品，dna提取方式不同。其中，通過收集環(huán)境中的水樣，并將采集的水樣品的菌懸液抽濾到0.22μm的濾膜，使用qiaamp?dna?micro?kit試劑盒提取濾膜dna；空氣和土樣直接用試劑盒提取，也可以用常規(guī)的ctab方法提取。

9、(3)dna宏條形碼監(jiān)測：通過比較不同環(huán)境樣本間的宏條形碼數據，實現dna宏條形碼數據100％注釋分類單元為監(jiān)測目標植物病原菌的物種；

10、(4)taqman熒光定量qpcr檢測：實時熒光pcr檢測方法時，設計的taqman?mgb探針對目標植物病原菌表現出特異性陽性擴增，且與近緣種及其他常見的真菌病菌無交叉反應，即可。

11、本發(fā)明中對環(huán)境樣品edna進行宏條形碼鑒定，篩查出檢疫物種后，再用qpcr的方法進行精準鑒定和定量測定初始濃度。

12、所有的環(huán)境樣品，包括空氣、水、土壤等環(huán)境樣品：

13、所述空氣樣品采用空氣孢子收集器進行采集，每個樣點將裝有空氣濾膜的空氣孢子收集器敞口置于農田中央，暴露8～12min且每張膜2～4個重復，每點收集1張膜并將濾膜放置于培養(yǎng)皿中用封口膜進行封口；

14、所述水樣主要為農田水，在每個采樣點采用1000ml采水袋收集水樣并低溫保存；

15、所述土壤、沉積物和根的樣品采用五點取樣法進行采集，先去除表層土壤0.4～0.6cm，采集表土下0.5～5.0cm深處的土壤，將5個點的土壤等量混勻裝入無菌自封袋；將采集的所有樣品歸類、編號并分為三份，詳細記錄樣品采集時間、地點、海拔以及樣點的環(huán)境信息。樣品采集后低溫保存運回實驗室，置于–85-–75℃保存?zhèn)溆谩?/p>

16、edna樣品采集是一個涉及多個步驟的復雜過程，不同樣品類型的采集方式、保存、處理等方式都重要。

17、所述步驟(3)和和步驟(4)中目標植物病原菌為落葉松芽枯病菌。

18、所述步驟(4)中以采集樣點空氣、水、土壤等環(huán)境樣品的總dna為模板，通過落葉松芽枯病菌(cladosporium?tenuissimum)的進行taqman熒光定量pcr檢測，監(jiān)測環(huán)境中的落葉松芽枯病菌的分布狀況。

19、其中落葉松芽枯病菌的特異性引物對，正向引物clte-f核苷酸序列如seq?idno.3所示，反向引物clte-r核苷酸序列如seq?id?no.4所示，其探針clte-fam核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

20、具體的特異性引物對clte-f：5’-gacagcattgccactcaaaaaa-3’(seq?id?no.3)；

21、clte-r：5’-cggcttcctgttgtggttgt-3’(seq?id?no.4)。

22、所述監(jiān)測落葉松芽枯病菌的引物探針，由權利要求1所述的引物組及特異探針組成，引物組正向引物序列如seq?id?no.3所示，反向引物序列如seq?id?no.4所示，探針為taqman?mgb探針，其核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

23、具體的，探針clte-fam：5’-cttacagagcacatcgc-3’(seq?id?no.5)。

24、本發(fā)明中一種基于edna及qpcr技術監(jiān)測植物病原真菌的試劑盒，包括上述的落葉松芽枯病菌的特異性引物對和探針組成的組合物。

25、本發(fā)明中上述試劑盒在鑒定植物病原真菌中的應用。

26、本發(fā)明克服了edna技術對環(huán)境中大部分物種進行檢測篩查時易受檢測靶標在總體樣品中的豐度影響，且由于片段較短準確度相對較低的技術問題，在該技術路線內引入qpcr，可對環(huán)境樣品中目標病原菌(落葉松芽枯病菌)進行二次準確檢測，能夠精準的鑒定到物種水平，還可計算獲得其定量初始濃度。qpcr檢測需要使用特異性的引物和探針，確保有目標植物病原真菌的dna能夠被擴增和檢測。

27、本發(fā)明中edna技術監(jiān)測方法，利用edna宏條形碼的方法進行初篩，然后結合培養(yǎng)組的方法獲得物種，之后用qpcr的方法進行快速鑒定。具體為利用edna宏條形碼，結合多基因條形碼鑒定，或者edna宏條形碼結合qpcr鑒定方法實現環(huán)境樣品中植物病原真菌的初篩和精準鑒定，實現有效監(jiān)測。

28、本發(fā)明中方法高效、準確，具有良好的可重復性和穩(wěn)定性，可以從不同的環(huán)境樣品中直接監(jiān)測植物病原真菌，適用于空氣、水、土壤等環(huán)境樣品中監(jiān)測，對于檢疫物種的初篩和精準識別非常重要。