本發(fā)明涉及對b細胞成熟抗原(bcma)具有特異性的嵌合抗原受體(car)和包括這種car的工程化的細胞及其使用方法。

背景技術(shù)：

1、b細胞成熟抗原(bcma)，也稱為tnfrsf17或cd269，是一種iii型跨膜蛋白，其缺乏信號肽并含有富含半胱氨酸的胞外域。bcma與密切相關(guān)的蛋白質(zhì)一起促進b細胞在發(fā)育的不同階段存活。bcma僅在b細胞譜系細胞中表達，特別是在生發(fā)中心的濾泡間區(qū)以及成漿細胞和分化漿細胞中表達。bcma在漿細胞分化過程中被選擇性誘導(dǎo)，并且是長壽命漿細胞在骨髓中最佳存活所必需的。在多發(fā)性骨髓瘤中，bcma在惡性漿細胞上以升高的水平廣泛表達，并且bcma表達隨著從正常細胞向活躍的多發(fā)性骨髓瘤進展而增加。bcma在其他b細胞惡性腫瘤中也有表達，包括氏巨球蛋白血癥、伯基特淋巴瘤和彌漫性大b細胞淋巴瘤。tai等人,immunotherapy,7(11):1187-1199,2015。

2、過繼性免疫療法涉及體外產(chǎn)生的自體抗原特異性t細胞的轉(zhuǎn)移，是治療病毒感染和癌癥的有前途的策略。用于過繼性免疫療法的t細胞可以通過抗原特異性t細胞的擴增或通過基因工程改造的t細胞的重定向來產(chǎn)生。

3、通過轉(zhuǎn)基因t細胞受體或嵌合抗原受體(car)的基因轉(zhuǎn)移，已成功地在t細胞中產(chǎn)生了新的特異性(jena,dotti等人2010)。car是由與單個融合分子中的一個或多個信號傳導(dǎo)域相關(guān)的靶向部分組成的合成受體。通常，car的結(jié)合部分由單鏈抗體(scfv)的抗原結(jié)合域組成，其包括單克隆抗體的通過柔性接頭連接的輕鏈和重鏈可變片段。第一代car的信號傳導(dǎo)域衍生自cd3zeta或fc受體gamma鏈的胞質(zhì)區(qū)。第一代car已被證明可以成功地重定向t細胞的細胞毒性。然而，它們不能在體內(nèi)提供延長的擴增和抗腫瘤活性。已添加了來自共刺激分子的信號傳導(dǎo)域以及跨膜和鉸鏈域來形成第二代和第三代car，從而對人類進行了一些成功的治療性試驗。例如，對b細胞分化抗原cd19具有特異性的car重定向t細胞在治療b細胞惡性腫瘤方面顯示出顯著功效，而tcr重定向t細胞顯示出對患有實體腫瘤的患者有益處。stauss等人描述了修飾治療性car和tcr的策略，以用于治療癌癥，例如增強抗原特異性效應(yīng)子功能并限制工程化的t細胞的毒性(current?opinion?in?pharmacology2015,24:113-118)。

4、表達靶向bcma的嵌合抗原受體的工程化的細胞可用于這樣的治療環(huán)境：其中，需要對表達bcma的細胞進行特異性靶向和t細胞介導(dǎo)的殺傷。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在一個方面，本發(fā)明提供了一種b細胞成熟抗原(bcma)特異性嵌合抗原受體，其從n端到c端包括：(a)包括抗bcma抗原結(jié)合域的胞外配體結(jié)合域；(b)鉸鏈；(c)跨膜域；以及(d)包括共刺激域和信號傳導(dǎo)域的胞質(zhì)域。

2、在一些情況下，所述胞外配體結(jié)合域包括抗bcma單鏈可變片段(scfv)域，其包括輕鏈可變區(qū)(lcvr)和重鏈可變區(qū)(hcvr)。在一些實施方式中，所述抗bcmascfv域包括在所述lcvr和所述hcvr之間的接頭。在一些情況下，所述嵌合抗原受體還包括在所述胞外配體結(jié)合域(例如，所述scfv域)與所述鉸鏈之間的接頭。在一些情況下，所述接頭包括選自由seq?id?no:93-96組成的組的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述接頭是(g4s)n接頭，其中，n為1-10。

3、在一些情況下，所述鉸鏈、所述跨膜域或兩者來自cd8α多肽。在一些情況下，所述共刺激域包括4-1bb共刺激域。在一些情況下，所述信號傳導(dǎo)域包括cd3zeta信號傳導(dǎo)域。在一些實施方式中，所述鉸鏈包括seq?id?no:97的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述跨膜域包括seq?id?no:98的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述4-1bb共刺激域包括seq?idno:99的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述cd3zeta信號傳導(dǎo)域包括seq?id?no:100的氨基酸序列。

4、在一些情況下，所述lcvr包括lcvr的互補決定區(qū)(cdr)，其包括選自由seq?id?no:10、26、42、58和74組成的組的氨基酸序列。在一些情況下，所述lcvr包括lcdr1-lcdr2-lcdr3域，其分別包括seq?id?no:12-14-16、28-30-32、44-46-48、60-62-64或76-78-80的氨基酸序列。在一些情況下，所述hcvr包括hcvr的cdr，其包括選自由seq?id?no:2、18、34、50和66組成的組的氨基酸序列。在一些情況下，所述hcvr包括hcdr1-hcdr2-hcdr3域，其分別包括seq?id?no:4-6-8、20-22-24、36-38-40、52-54-56或68-70-72的氨基酸序列。

5、在一些實施方式中，所述lcvr包括選自由seq?id?no:10、26、42、58和74組成的組的氨基酸序列，或具有與選自由seq?id?no:10、26、42、58和74組成的組的氨基酸序列的95％-99％的序列同一性的氨基酸序列；并且所述hcvr包括選自由seq?id?no:2、18、34、50和66組成的組的氨基酸序列，或具有與選自由seq?id?no:2、18、34、50和66組成的組的氨基酸序列的95％-99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些情況下，所述lcvr包括選自由seqid?no:10、26、42、58和74組成的組的氨基酸序列，并且所述hcvr包括選自由seq?id?no:2、18、34、50和66組成的組的氨基酸序列。

6、在一些實施方式中，所述scfv域包括lcvr/hcvr氨基酸序列對，其包括seq?id?no:10/2、26/18、42/34、58/50或74/66的氨基酸序列。在一些情況下，所述lcvr和hcvr通過接頭連接，任選地通過(g4s)n接頭連接，其中，n＝1-3。

7、在一些情況下，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:82、seq?id?no:84、seq?id?no:86、seq?id?no:88或seq?id?no:90的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:82的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:84的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:86的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:88的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:90的氨基酸序列。

8、在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其編碼上文或本文討論的嵌合抗原受體。在一些情況下，所述核酸分子包括選自由seq?id?no:81、83、85、87和89組成的組的核苷酸序列。

9、在另一方面，本發(fā)明提供了一種包括上文或本文討論的核酸分子的載體。在一些情況下，所述載體是dna載體、rna載體、質(zhì)粒、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些實施方式中，所述載體是慢病毒載體。

10、在另一方面，本發(fā)明提供了一種包括上文或本文討論的核酸分子或載體的細胞。在一些情況下，所述細胞是人類t細胞。

11、在另一方面，本發(fā)明提供了一種工程化的細胞，包括上文或本文討論的嵌合抗原受體。在一些情況下，所述工程化的細胞是免疫細胞。在一些情況下，所述免疫細胞是免疫效應(yīng)子細胞。在一些情況下，所述免疫效應(yīng)子細胞是t淋巴細胞。在一些實施方式中，所述t淋巴細胞是炎性t淋巴細胞、細胞毒性t淋巴細胞、調(diào)節(jié)性t淋巴細胞或輔助性t淋巴細胞。在一些實施方式中，所述工程化的細胞是cd8+細胞毒性t淋巴細胞。

12、在一些情況下，本發(fā)明的工程化的細胞用于治療bcma表達的癌癥。在一些情況下，所述bcma表達的癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。

13、在另一方面，本發(fā)明提供了一種包括嵌合抗原受體的工程化的人類t細胞，所述嵌合抗原受體從n端到c端包括：(a)包括抗bcma單鏈可變片段(scfv)域的胞外配體結(jié)合域，其包括輕鏈可變區(qū)(lcvr)和重鏈可變區(qū)(hcvr)；(b)鉸鏈；(c)跨膜域；以及(d)包括4-1bb共刺激域和cd3zeta信號傳導(dǎo)域的胞質(zhì)域。

14、在一些情況下，所述scfv域包括lcvr/hcvr氨基酸序列對，其包括seq?id?no:10/2、26/18、42/34、58/50或74/66的氨基酸序列。在一些情況下，所述鉸鏈包括seq?id?no:97的氨基酸序列。在一些情況下，所述跨膜域包括seq?id?no:98的氨基酸序列。在一些情況下，所述4-1bb共刺激域包括seq?id?no:99的氨基酸序列。在一些情況下，所述cd3zeta信號傳導(dǎo)域包括seq?id?no:100的氨基酸序列。

15、在一些實施方式中，所述工程化的人類t細胞包括嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:82的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述工程化的人類t細胞包括嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:84的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述工程化的人類t細胞包括嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:86的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述工程化的人類t細胞包括嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:88的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述工程化的人類t細胞包括嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括seq?id?no:90的氨基酸序列。

16、在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括基因修飾的人類t細胞和藥學(xué)上可接受的載體，其中，所述基因修飾的人類t細胞包括上文或本文討論的嵌合抗原受體。在一些情況下，所述藥物組合物用于治療bcma表達的癌癥。在一些實施方式中，所述bcma表達的癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。

17、在另一方面，本發(fā)明提供了一種上文或本文討論的工程化的細胞。在一些情況下，所述藥物組合物用于治療bcma表達的癌癥。在一些實施方式中，所述bcma表達的癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。

18、在另一方面，本發(fā)明提供了上文或本文討論的嵌合抗原受體、核酸分子、載體、細胞或工程化的細胞在制備用于治療bcma表達的癌癥的藥物中的用途。在一些情況下，所述bcma表達的癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。在各種實施方式中，可以想到將上文或本文討論的嵌合抗原受體、核酸分子、載體、細胞或工程化的細胞用于上文或本文討論的任何方法。例如，在一些實施方式中，將本文討論的car或工程化的細胞用于藥物或用于治療上文或本文討論的癌癥。

19、在另一方面，本發(fā)明提供了一種對受試者增強t淋巴細胞活性的方法，包括：將包括上文或本文討論的嵌合抗原受體的t淋巴細胞引入所述受試者。

20、在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有癌癥的受試者的方法，包括：將治療有效量的包括上文或本文討論的嵌合抗原受體的t淋巴細胞引入所述受試者。

21、在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于對受試者刺激對靶細胞群體或組織的t細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法，包括：向所述受試者給藥有效量的經(jīng)基因修飾以表達上文或本文討論的嵌合抗原受體的細胞。

22、在另一方面，本發(fā)明提供了一種對受試者提供抗腫瘤免疫力的方法，所述方法包括：向所述受試者給藥有效量的經(jīng)基因修飾以表達上文或本文討論的嵌合抗原受體的細胞。

23、在上文討論的方法的一些實施方式中，所述受試者是人類。在一些情況下，所述受試者患有多發(fā)性骨髓瘤、b譜系急性淋巴細胞性白血病、b細胞慢性淋巴細胞性白血病、b細胞非霍奇金氏淋巴瘤、白血病和淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、霍奇金氏淋巴瘤或兒童急性淋巴細胞性白血病。在一些實施方式中，所述受試者患有多發(fā)性骨髓瘤。

24、在另一方面，本發(fā)明提供了一種工程化細胞群以表達嵌合抗原受體的方法，其中，所述包括：(a)提供免疫細胞群體；(b)將編碼上文或本文討論的嵌合抗原受體的核酸分子引入所述免疫細胞；(c)在表達所述核酸分子的條件下培養(yǎng)所述免疫細胞；以及(d)分離在細胞表面表達所述嵌合抗原受體的所述免疫細胞。在一些情況下，所述方法進一步包括：在引入所述核酸分子之前從受試者獲得所述免疫細胞群體。

25、在另一方面，本發(fā)明提供了一種對受試者治療bcma表達的癌癥的方法，其中，所述方法包括：(a)根據(jù)上文討論的方法工程化細胞群體；以及(b)將表達所述嵌合抗原受體的所述免疫細胞群體重新引入所述受試者。在一些實施方式中，所述bcma表達的癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。

26、通過閱讀隨后的詳細描述，其他實施方式將變得顯而易見。