本發(fā)明涉及工程酶領(lǐng)域，具體涉及一種溶劑耐受型轉(zhuǎn)氨酶突變體、基因工程菌及在制備瑞美吉泮中間體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、手性胺是許多重要生物活性分子的結(jié)構(gòu)單元和合成很多手性藥物的關(guān)鍵中間體。目前，主要有三種方法可以用于手性胺的合成，包括化學(xué)法、生物拆分法和生物不對稱合成法。其中，化學(xué)法中存在反應(yīng)路線較長、且條件苛刻，存在合成中使用有毒的過渡態(tài)金屬催化劑、產(chǎn)品立體選擇性低、產(chǎn)率低等缺點(diǎn)；而生物拆分法的理論最高收率只有50％，這兩種方法在放大生產(chǎn)上都有存在一定的局限性。轉(zhuǎn)氨酶催化的生物不對稱合成手性胺，由于具有高選擇性、高轉(zhuǎn)化率、反應(yīng)條件溫和以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的關(guān)注，現(xiàn)在已成為廣泛使用的一種手性胺的制備方法。然而，大多數(shù)野生型轉(zhuǎn)氨酶底物范圍有限，通常難以合成大位阻手性胺化合物。

2、瑞美吉泮(rimegepant)是一種小分子降鈣素基因相關(guān)肽(cgrp)受體拮抗劑，專門用于偏頭痛的急性治療和預(yù)防。其機(jī)制是通過阻斷cgrp的活性，從而減輕偏頭痛的癥狀。瑞美吉泮于2020年在美國首次上市，并在2024年獲得中國的批準(zhǔn)，成為首個(gè)同時(shí)適用于急性和預(yù)防性治療的藥物。目前公認(rèn)的偏頭痛病理生理學(xué)理論認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(特別是三叉神經(jīng)節(jié))功能障礙是該疾病的根本原因。三叉神經(jīng)節(jié)的刺激觸發(fā)三叉神經(jīng)傳入神經(jīng)的激活，這些傳入神經(jīng)投射到脊髓和顱內(nèi)和顱外的各種感知疼痛的突觸。然后，疼痛信號通過二級上行神經(jīng)元進(jìn)一步傳遞到腦干、下丘腦和丘腦核，并從那里傳遞到聽覺、視覺等幾個(gè)皮質(zhì)區(qū)域。三叉神經(jīng)節(jié)通過激活血管周圍纖維和釋放參與疼痛產(chǎn)生的分子(cgrp)，來放大和維持偏頭痛。cgrp水平在偏頭痛發(fā)作期間急性升高，在用曲坦類藥物治療后恢復(fù)正常，并且已顯示cgrp的靜脈輸注會在偏頭痛患者中觸發(fā)偏頭痛樣頭痛。除了其血管舒張?zhí)匦灾?，cgrp似乎是一種通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性以促進(jìn)疼痛反應(yīng)的促痛因子。瑞美吉泮是cgrp受體的拮抗劑，它與cgrp競爭占據(jù)這些受體，阻止cgrp的作用及其放大和維持偏頭痛的能力，最終緩解頭痛。

3、近年來，由于化學(xué)-酶法具有高選擇性及環(huán)境優(yōu)化的優(yōu)勢，逐步成為合成手性醫(yī)藥化學(xué)品及其中間體的首選方案。ω-轉(zhuǎn)氨酶是生產(chǎn)瑞美吉泮的關(guān)鍵酶。許多ω-轉(zhuǎn)氨酶基因已被克隆，其中部分轉(zhuǎn)氨酶的基因已在不同的宿主(大腸桿菌、畢赤酵母等)中表達(dá)，獲得了酶活和選擇性都較高的基因工程菌。盡管如此，對于r-型選擇性轉(zhuǎn)氨的天然ω-轉(zhuǎn)氨酶報(bào)道很少，且這些ω-轉(zhuǎn)氨酶催化的底物譜較窄，往往是為特定反應(yīng)篩選的最適生物催化劑，因此大大限制了其應(yīng)用范圍。

4、中國專利cn116083385a、cn114875006a、cn113817699a、cn108048419a、cn112980899a、cn112980810a、cn112094830a、cn110592042a、cn108384767a公開了基于一種ω-轉(zhuǎn)氨酶的合理進(jìn)化策略，得到了對大空間位阻手性胺具有催化活性的酶變體，提高了轉(zhuǎn)氨酶在極端條件下的穩(wěn)定性。以進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)氨酶的固定化和連續(xù)化應(yīng)用，提高生產(chǎn)效率，但是存在轉(zhuǎn)化率較低的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服轉(zhuǎn)氨酶催化活性低、熱穩(wěn)定性低、底物譜窄，以及現(xiàn)有合成瑞美吉泮或其手性氨基中間體的工程化轉(zhuǎn)氨酶技術(shù)中存在的生產(chǎn)效率低、催化劑價(jià)格昂貴等問題，提供了一種溶劑耐受型轉(zhuǎn)氨酶突變體、基因工程菌及在制備瑞美吉泮中間體中的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明首先提供了一種ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體是將seq?id?no.2所示氨基酸序列第22位、第398位、第419位進(jìn)行單位點(diǎn)或多點(diǎn)聯(lián)合突變獲得。

4、ω-轉(zhuǎn)氨酶是轉(zhuǎn)氨酶家族中唯一一類可以轉(zhuǎn)移氨基酸非α位上氨基的酶。ω-轉(zhuǎn)氨酶普遍存在于動物、植物組織和微生物中，在動物組織的心肌、腦、肝、腎等部位，ω-轉(zhuǎn)氨酶含量相對較高。ω-轉(zhuǎn)氨酶能夠催化脂肪族及芳香族酮酸、醛、酮及酮糖等底物的區(qū)域選擇性和立體選擇性轉(zhuǎn)氨反應(yīng)。這種反應(yīng)對于合成手性胺、氨基酸及其衍生物具有重要意義。

5、作為優(yōu)選，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體是將seq?id?no.2所示氨基酸序列突變?yōu)橄铝兄唬?1)第22位的苯丙氨酸突變成亮氨酸；(2)第22位的苯丙氨酸突變成亮氨酸、第398位的甘氨酸突變成丙氨酸；(3)第22位的苯丙氨酸突變成亮氨酸、第398位的甘氨酸突變成丙氨酸、同時(shí)第419位的甘氨酸突變成蘇氨酸。

6、第二方面，本發(fā)明提供了一種含有ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的編碼基因。

7、所述第22位的苯丙氨酸突變成亮氨酸即為f22l，氨基酸序列如seq?id?no.4所示，核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述第22位的苯丙氨酸突變成亮氨酸、第398位的甘氨酸突變成丙氨酸，即為f22l/g398a，氨基酸序列如seq?id?no.6所示，核苷酸序列如seq?idno.5所示；所述第22位的苯丙氨酸突變成亮氨酸、第398位的甘氨酸突變成丙氨酸、同時(shí)第419位的甘氨酸突變成蘇氨酸，即為f22l/g398a/g419t，氨基酸序列如seq?id?no.8所示，核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

8、本發(fā)明ω-轉(zhuǎn)氨酶(seq?id?no.2所示的氨基酸序列)來源于紫色色桿菌(chromobacterium?violaceum)，也可以從重組表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化體中分離獲得，還可以人工合成獲得。兩條氨基酸序列或兩條核苷酸序列之間的同一性均可通過本領(lǐng)域常用的算法得到，優(yōu)選采用ncbi?blastp和blastn軟件根據(jù)默認(rèn)參數(shù)計(jì)算得到。

9、本發(fā)明seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?id?no.8所示氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有轉(zhuǎn)氨酶活性的衍生的氨基酸序列，具有至少95％同一性的蛋白質(zhì)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

10、由于核苷酸密碼子的簡并性，編碼seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?id?no.8的氨基酸序列的多核苷酸序列不僅僅局限于seq?id?no.3、seq?id?no.5、seq?id?no.7,也可以是編碼序列表中seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?id?no.8所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。

11、第三方面，本發(fā)明提供一種編碼基因的重組載體。

12、本發(fā)明所述重組載體以pet-28a(+)為基礎(chǔ)質(zhì)粒。

13、第四方面，本發(fā)明提供一種編碼基因的基因工程菌。

14、本發(fā)明所述基因工程菌以大腸桿菌bl21(de3)為宿主菌。

15、第五方面，本發(fā)明提供一種所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體在微生物催化瑞美吉泮中間體前體酮制備瑞美吉泮中間體中的應(yīng)用。

16、作為優(yōu)選，所述應(yīng)用以含ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因的重組基因工程菌獲得的濕菌體或濕菌體超聲破碎提取的純酶液為催化劑，配制緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，進(jìn)行生物催化反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液分離純化，獲得(5s，6s，9r)-5-氨基-6-(2,3-二氟苯基)-6,7,8,9-四氫-5h-環(huán)庚[b]吡啶-9-醇二鹽酸鹽；所述瑞美吉泮中間體前體酮是指(6s，9r)-6-(2,3-二氟苯基)-9-羥基-6,7,8,9-四氫-5h-環(huán)庚[b]吡啶-5-酮。

17、本發(fā)明以瑞美吉泮中間體前體酮為底物，以二甲基亞砜(甲醇)為助溶劑、以磷酸吡哆醛(plp)為輔酶、以異丙胺鹽酸鹽為輔底物，以ph?9.0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在45℃-55℃、800rpm-1200rpm條件下進(jìn)行生物催化反應(yīng)。

18、本發(fā)明所述濕菌體用量為100g/l，純酶液用量以蛋白含量計(jì)為200-300g/l。當(dāng)?shù)孜锝K濃度為10g/l，甲醇體積終濃度為10～30％，磷酸吡哆醛0.25～2g/l，異丙胺鹽酸鹽82.59g/l。當(dāng)?shù)孜锝K濃度為10g/l時(shí)，甲醇體積終濃度為10～30％，磷酸吡哆醛0.25～2g/l，異丙胺鹽酸鹽412.96g/l。

19、作為優(yōu)選，所述濕菌體按如下方法制備：將含ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因的重組基因工程菌接種至含有卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，再接種至新鮮的卡那霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入iptg誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心棄去上清液，收集沉淀，即獲得所述的濕菌體。

20、本發(fā)明所述重組基因工程菌培養(yǎng)方法為：接種至含有50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基，35-39℃，150rpm-250rpm下培養(yǎng)11h-13h。培養(yǎng)得到所述基因工程菌后，再以體積濃度1％-3％接種量接種至新鮮的含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中，于35℃-39℃，100rpm-200rpm下培養(yǎng)至菌體od600達(dá)0.6～0.8，加入終濃度為0.1mm的iptg，26℃-30℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)10h-14h后，4℃、7000rpm-9000rpm離心10min，棄去上清液，收集沉淀，即獲得所述的濕菌體。

21、作為優(yōu)選，所述純酶液按如下方法制備：將所述濕菌體以結(jié)合緩沖液重懸后，冰浴條件下破碎，離心，除去雜蛋白，隨后以緩沖液洗脫并收集目的蛋白，磷酸鈉緩沖液透析，收集截流液即為純酶液。

22、本發(fā)明所述緩沖液為50mm，ph7.0-9.0的磷酸鈉緩沖液，含250mm-350mm?nacl。在冰浴的情況下超聲破碎，300w破碎10min，工作1s暫停3s，11000rpm-13000rpm離心10min，上清與經(jīng)上述結(jié)合液平衡過的ni親和層析樹脂孵育后，再用沖洗緩沖液沖洗至基本無雜蛋白，隨后以洗脫緩沖液。電泳鑒定純度后合并目的蛋白并以透析緩沖液，透析48h后收集截流液即為純酶液。

23、作為優(yōu)選，所述催化劑包括ω-轉(zhuǎn)氨酶及其突變體的重組基因工程菌濕菌體、粗酶液、粗酶粉、純酶液。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

25、(1)本發(fā)明提供的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，對于瑞美吉泮中間體的制備合成轉(zhuǎn)化率、有機(jī)溶劑耐受性和產(chǎn)物立體選擇性均較高，相較于現(xiàn)有技術(shù)，具有較好工業(yè)應(yīng)用前景。

26、(2)本發(fā)明所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體在微生物催化瑞美吉泮中間體前體酮制備瑞美吉泮中間體中的應(yīng)用中，成本較低，有利于廣泛適用。