本發(fā)明屬于細(xì)胞核提取，具體涉及一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞核提取(nuclear?extraction)是生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)，用于分離細(xì)胞核并獲取其中的核酸(如dna和rna)、蛋白質(zhì)以及其他核內(nèi)成分。細(xì)胞核是細(xì)胞的控制中心，在細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、分化中起著重要作用，是遺傳物質(zhì)的主要存在部位。細(xì)胞核內(nèi)含有遺傳物質(zhì)dna，這些dna攜帶著生物體的遺傳信息，對(duì)生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等生命活動(dòng)起著決定性的作用。因此，細(xì)胞核提取是研究基因表達(dá)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等領(lǐng)域的關(guān)鍵步驟。

2、與動(dòng)物細(xì)胞核相比，植物細(xì)胞核的提取面臨更大的挑戰(zhàn)，因?yàn)橹参锛?xì)胞具有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，增加了細(xì)胞核提取的難度。同時(shí)，植物細(xì)胞中還富含葉綠體等細(xì)胞器，在提取過程中容易對(duì)細(xì)胞核造成污染。此外，植物細(xì)胞核的提取還受到物種差異、組織類型、發(fā)育階段等多種因素的影響。

3、在同一植物體內(nèi)或不同植物體之間，其細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、組成和功能上存在的差異，因此植物的細(xì)胞核提取方式也需要相應(yīng)地進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化，以適應(yīng)不同細(xì)胞類型的特性和提取需求。其中，凍存的植物葉片組織可以在極低溫度下長(zhǎng)期保存，維持其生物學(xué)活性和分子穩(wěn)定性，為后續(xù)的細(xì)胞核提取和分析提供了穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)材料。但是植物組織凍存過程中，細(xì)胞膜可能受到損傷，增加了細(xì)胞核提取的難度。因此，本發(fā)明開發(fā)一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中凍存水稻葉片組織細(xì)胞核提取時(shí)缺乏合適的裂解液導(dǎo)致細(xì)胞核純度不高和生物活性低的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明開發(fā)一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中凍存水稻葉片組織細(xì)胞核提取時(shí)缺乏合適的裂解液導(dǎo)致細(xì)胞核純度不高和生物活性低的技術(shù)問題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液，包括以下成分：mes-koh緩沖液、nacl溶液、kcl溶液、mgcl2溶液、edta溶液和蔗糖溶液。

4、進(jìn)一步地，mes-koh緩沖液的ph值為5.7，濃度為4m；nacl溶液的濃度為5m；kcl溶液的濃度為1m；mgcl2溶液的濃度為1m；edta溶液的濃度為0.5m；蔗糖溶液的濃度為2.3m。

5、進(jìn)一步地，mes-koh緩沖液、nacl溶液、kcl溶液、mgcl2溶液、edta溶液和蔗糖溶液的體積之比為5：4：20：6：10：125；

6、進(jìn)一步地，所述mes-koh溶液由2-嗎啉乙磺酸溶液經(jīng)koh溶液調(diào)節(jié)ph值至5.7制備得到；

7、進(jìn)一步地，所述裂解液-20℃保存，使用時(shí)解凍，解凍后2-4℃保存。

8、本發(fā)明還提供一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液在凍存水稻組織細(xì)胞核提取中的應(yīng)用，包括如下步驟：

9、(1)裂解：將新鮮凍存水稻葉片在低溫條件下采用刀片劃痕的方式進(jìn)行破碎，然后解離，得到凍存水稻葉片組織細(xì)胞核溶液；

10、(2)分離：將凍存水稻葉片組織細(xì)胞核溶液置于4℃預(yù)冷離心機(jī)中進(jìn)行離心，去除上清，得到凍存水稻葉片組織細(xì)胞核沉淀；

11、(3)洗滌：向凍存水稻葉片組織細(xì)胞核沉淀加入凍存水稻葉片組織細(xì)胞核洗滌液，重懸，置于4℃預(yù)冷離心機(jī)中進(jìn)行離心，去除上清，得到洗滌后的凍存水稻葉片組織細(xì)胞核沉淀；

12、(4)重復(fù)步驟(3)，得到純化的凍存水稻葉片組織細(xì)胞核沉淀。

13、進(jìn)一步地，所述一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液的應(yīng)用，步驟(1)包括如下流程：

14、q1、劃痕處理：將新鮮凍存水稻葉片組織樣本置于預(yù)冷的玻璃板上，加入預(yù)冷的提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液，用無菌的手術(shù)刀片進(jìn)行劃痕，得到切碎的凍存水稻葉片組織；

15、q2、解離：將切碎的凍存水稻葉片組織用預(yù)冷的提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液沖洗到無菌的ep離心管中，在室溫的條件下置于搖床上解離，結(jié)束后，得到凍存水稻葉片組織細(xì)胞核溶液。

16、進(jìn)一步地，q1中水稻葉片的真葉數(shù)為6，新鮮凍存水稻葉片組織樣本的質(zhì)量為500-800mg，提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液的預(yù)冷的溫度為2-4℃，加入的體積為1ml，劃痕時(shí)間為2min；q2中提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液加入的體積為4ml，ep離心管的容積為15ml或50ml，解離的時(shí)間為5min。

17、進(jìn)一步地，步驟(2)中離心的轉(zhuǎn)速為500-800g，離心的時(shí)間為5-8分鐘；步驟(3)中凍存水稻葉片組織細(xì)胞核洗滌液與凍存水稻葉片組織細(xì)胞核溶液的體積之比為1-2：1，凍存水稻葉片組織細(xì)胞核洗滌液由4m?mes-koh緩沖液、5mnacl溶液、1m?kcl溶液、1m?mgcl2溶液和2.3m蔗糖溶液按照體積比為5：4：20：6：125混合得到，4m?mes-koh緩沖液的ph值為5.7，離心的轉(zhuǎn)速為500-800g，離心的時(shí)間為5-8分鐘。

18、綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

19、1、本發(fā)明通過預(yù)冷的裂解液和無菌手術(shù)刀片對(duì)新鮮凍存的水稻葉片進(jìn)行劃痕處理，能夠有效破碎葉片組織，在搖床上的解離步驟進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞核的釋放，不僅提高了提取效率，還減少了因溫度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞核降解風(fēng)險(xiǎn)；mes(2-嗎啉乙磺酸)是一種弱酸性緩沖液，適合在接近生理ph的條件下維持細(xì)胞核的穩(wěn)定性，ph值調(diào)節(jié)至5.7，接近植物細(xì)胞的生理ph范圍，有助于保護(hù)細(xì)胞核的完整性；nacl、kcl、mgcl2溶液作為鹽類成分，用于維持滲透壓平衡，防止細(xì)胞核在裂解過程中因滲透壓變化而破裂，而且mgcl2還能穩(wěn)定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，保護(hù)細(xì)胞核的dna，edta是一種金屬離子螯合劑，可以抑制核酸酶的活性，防止dna降解，蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)劑，能夠維持細(xì)胞核的形態(tài)和功能，同時(shí)有助于在離心過程中分離細(xì)胞核。因此，本發(fā)明的裂解液能夠有效保護(hù)水稻葉片組織細(xì)胞核的完整性。

20、2、本發(fā)明通過從凍存水稻葉片組織中獲取細(xì)胞核，仍然保持著其天然狀態(tài)，并且保留了大部分的原始基因組，可更好地反映細(xì)胞核在體內(nèi)的真實(shí)狀態(tài)，從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)，很適合用于染色質(zhì)可及性分析、染色質(zhì)免疫共沉淀及其他轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。此外，采用刀片劃痕的方式進(jìn)行解離，是一個(gè)快速獲取凍存水稻葉組織細(xì)胞核的技術(shù)方法，克服了現(xiàn)有液氮研磨及消化技術(shù)損耗材料且組織碎片污染程度高的過程，極大的節(jié)約了樣本量，可用于快速獲取植物凍存水稻組織細(xì)胞核及其他類似植物組織細(xì)胞核獲取，為少量樣本及凍存類樣本提供了繼續(xù)科研的可能。

技術(shù)特征：

1.一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液，其特征在于，包括以下成分：4m?mes-koh緩沖液、5m?nacl溶液、1m?kcl溶液、1m?mgcl2溶液、0.5m?edta溶液和2.3m蔗糖溶液；mes-koh緩沖液、nacl溶液、kcl溶液、mgcl2溶液、edta溶液和蔗糖溶液的體積之比為5：4：20：6：10：125。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液，其特征在于，所述mes-koh溶液由2-嗎啉乙磺酸溶液經(jīng)koh溶液調(diào)節(jié)ph值至5.7制備得到。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液，其特征在于，所述裂解液-20℃保存，使用時(shí)解凍，解凍后2-4℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液在凍存水稻組織細(xì)胞核提取中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液在凍存水稻組織細(xì)胞核提取中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(1)包括如下流程：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液在凍存水稻組織細(xì)胞核提取中的應(yīng)用，其特征在于，q1中水稻葉片的真葉數(shù)為6，新鮮凍存水稻葉片組織樣本的質(zhì)量為500-800mg，提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液的預(yù)冷的溫度為2-4℃，加入的體積為1ml，劃痕時(shí)間為2min。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液在凍存水稻組織細(xì)胞核提取中的應(yīng)用，其特征在于，q2中提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液加入的體積為4ml，ep離心管的容積為15ml或50ml，解離的時(shí)間為5min。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液在凍存水稻組織細(xì)胞核提取中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中離心的轉(zhuǎn)速為500-800g，離心的時(shí)間為5-8分鐘。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液在凍存水稻組織細(xì)胞核提取中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中凍存水稻葉片組織細(xì)胞核洗滌液與凍存水稻葉片組織細(xì)胞核溶液的體積之比為1-2：1，凍存水稻葉片組織細(xì)胞核洗滌液由4m?mes-koh緩沖液、5m?nacl溶液、1m?kcl溶液、1m?mgcl2溶液和2.3m蔗糖溶液按照體積比為5：4：20：6：125混合得到，4m?mes-koh緩沖液的ph值為5.7。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液及其應(yīng)用，屬于細(xì)胞核提取技術(shù)領(lǐng)域。所述一種提取水稻葉片組織細(xì)胞核的裂解液，包括以下成分：4M?MES?KOH緩沖液、5M?NaCl溶液、1M?KCl溶液、1M?MgCl<subgt;2</subgt;溶液、0.5M?EDTA溶液和2.3M蔗糖溶液；所述MES?KOH溶液由2?嗎啉乙磺酸溶液經(jīng)KOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5.7制備得到；MES?KOH緩沖液、NaCl溶液、KCl溶液、MgCl<subgt;2</subgt;溶液、EDTA溶液和蔗糖溶液的體積之比為5：4：20：6：10：125。使用本發(fā)明的裂解液提取凍存水稻葉片組織細(xì)胞核時(shí)，能夠有效保護(hù)水稻葉片組織細(xì)胞核的完整性。

技術(shù)研發(fā)人員：徐俊,張潔梅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶生命知源科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8