本發(fā)明屬于食品及生物加工，涉及一種蛋白酶固定化方法及在活性肽制備中的應(yīng)用，具體涉及一種超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶的制備方法及應(yīng)用，尤其涉及制備生物活性肽相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、生物活性肽是由氨基酸組成的具有特定生理功能的短鏈肽，具有抗氧化、降血壓、抑菌、降血脂和維持血糖平衡等功能，可以開發(fā)成功能性食品、藥物或輔助治療產(chǎn)品，因此被廣泛應(yīng)用于食品、生物和醫(yī)藥等多個領(lǐng)域。利用蛋白酶水解結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不易溶解的大分子蛋白制備生物活性肽，可提高親本蛋白的生物利用度并降低致敏性，并且具有催化性能好且安全可靠的優(yōu)勢。然而，游離蛋白酶在使用過程中存在活性不穩(wěn)定、難以回收再利用、生產(chǎn)成本高等問題，且會發(fā)生蛋白酶分子間相互識別導(dǎo)致的自水解及自聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致蛋白酶催化效果降低甚至失活，因此需要對蛋白酶進行固定化處理。目前固定化技術(shù)包括化學(xué)交聯(lián)法，物理吸附和包埋等手段可一定程度提升蛋白酶的穩(wěn)定性，但仍存在酶結(jié)構(gòu)易改變或從載體脫落等難題。常用的固定化材料如大孔樹脂、硅膠等載體機械強度差，不耐溶劑腐蝕，并且難以從高粘度的蛋白液中分離回收再利用。此外，由于蛋白酶的活性及催化效率不穩(wěn)定，導(dǎo)致酶解制備的多肽分子量不可控。綜上，選用合適的載體材料和固定化手段是提升蛋白酶催化活性、穩(wěn)定性、回收和重復(fù)利用性，實現(xiàn)生物活性肽分子量可控可調(diào)制備的關(guān)鍵。

2、cn?108179143?a公開了一種磁性氧化石墨烯固定化酶及其在濕法玉米浸泡中的應(yīng)用，但該方法中固定化酶的制備是利用物理吸附將磁性氧化石墨烯材料與木瓜蛋白酶結(jié)合，存在酶易脫落等問題。此外，該專利并不能實現(xiàn)玉米淀粉中的蛋白質(zhì)完全水解，且水解后的多肽分子量大小及分布范圍不清，多肽的抗氧化活性也未知。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足而提供一種蛋白酶固定化方法及在活性肽制備中的應(yīng)用，具體為一種超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶的制備方法及應(yīng)用，具有固定化蛋白酶催化效率高效穩(wěn)定、磁性回收，制備的生物活性肽分子量可控可調(diào)并具有抗氧化活性等優(yōu)點，在食品及生物化工領(lǐng)域中應(yīng)用前景廣闊。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個技術(shù)目的是提供一種蛋白酶固定化方法，采用亞鐵鹽和鐵鹽改性的超順磁性氧化石墨烯為載體，通過表面活性劑引入羧酸官能團將載體表面功能化，實現(xiàn)蛋白酶與磁性氧化石墨烯載體共價結(jié)合制得，可有效提升固定化蛋白酶的催化穩(wěn)定性。

4、具體地，蛋白酶固定化方法操作如下：

5、(1)超順磁性氧化石墨烯納米載體(sgo)的制備

6、將0.1-1g氧化石墨烯加入0.05-0.5m氫氧化鈉溶液中，在室溫下超聲處理10-60min，8000-12000g離心收集得到目標(biāo)固體，并用去離子水洗滌至ph值達到中性；超聲處理將顆粒分散到10-20ml脫氣水中，加入5ml含有50-150mg/ml鐵鹽和10-100mg/ml亞鐵鹽的液體懸浮液，超聲處理30-180min，再加入10％-20％的氨水溶液，使懸浮液ph值達9-12；經(jīng)過反復(fù)洗滌和過濾后，在50-100℃烘箱中干燥過夜，得到超順磁性氧化石墨烯納米載體sgo；

7、(2)超順磁性氧化石墨烯納米載體的表面功能化

8、將0.1-1g經(jīng)步驟(1)制備的超順磁性氧化石墨烯納米載體sgo加入30-300ml、0.01-0.1m磷酸鹽緩沖液中，超聲水浴處理10-60min，隨后加入15-200ml、1-5m氫氧化鈉溶液并用超聲水浴處理60-300min，再加入5-12m鹽酸進行中和，經(jīng)過濾和沖洗處理，得到羧酸修飾的sgo；

9、將改性后的sgo用去離子水稀釋到0.5-2mg/ml，加入2-10mg表面活性劑超聲處理1-10min，并加入1-10mm?1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺edc并超聲處理，隨后加入edc(15～30mm)，充分攪拌后加入100-500ulβ-巰基乙醇終止反應(yīng)，8000-12000×g離心3-10min后用去離子水洗滌，20-60℃真空干燥得到表面功能化的磁性氧化石墨烯納米載體；

10、(3)超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶的制備

11、取0.01-0.1g經(jīng)步驟(2)制備的表面功能化的磁性氧化石墨烯納米載體分散于0.01-0.1m磷酸鹽緩沖液中制備懸浮液，用磷酸鹽緩沖液配制20-60mg/ml蛋白酶溶液；在sgo-pega懸浮液中加入0.1-2g蛋白酶溶液，室溫攪拌充分，離心收集固體，用磷酸鹽緩沖液進一步處理至少3次，最終制得超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶。

12、優(yōu)選地，所述亞鐵鹽選自氯化亞鐵、硫酸亞鐵、硝酸亞鐵或其水合物中的一種或幾種組合，所述鐵鹽選自氯化鐵、硫酸鐵、硝酸鐵或其水合物中的一種或幾種組合，所述表面活性劑選自聚乙二醇雙胺、乙二胺、鄰苯二胺中的一種或多種組合，,所述蛋白酶為木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶中的一種或多種組合。

13、進一步地，所述步驟(1)中所用鐵鹽和亞鐵鹽分別為含有fecl3·6h2o和fecl2·4h2o的水溶液，所述步驟(2)中磷酸鹽緩沖液的濃度為50mmol/l，ph?9.25；所述步驟(2)中改性后的sgo用去離子水稀釋到1mg/ml，所述步驟(3)中磷酸鹽緩沖液的濃度為50mg/ml，蛋白酶溶液的ph為6.5，sgo-pega懸浮液的ph為11。

14、進一步地，所述超順磁性氧化石墨烯納米載體的飽和磁化強度為-60-60emu/g，可通過磁場實現(xiàn)固定化蛋白酶的回收富集。

15、且，蛋白酶溶液與表面功能化的磁性氧化石墨烯載體的比值為1：1-1：10(v/w)。

16、進一步地，所述超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶的固載量為500-1500mg/h，固載率為10-60％，飽和磁化強度為-30-30emu/g，重復(fù)使用7次后仍能保持50％以上初始活性。

17、本發(fā)明的第二個技術(shù)目的是提供一種生物活性肽的制備方法，包括：

18、對目標(biāo)蛋白樣品進行預(yù)處理，處理完畢之后加入所述的超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶或游離酶，在一定溫度下攪拌或震蕩，進行一定時間的水解，水解結(jié)束后置于沸水中一定時間，離心，收集上清液即得到生物活性肽。

19、需要說明的是，固定化蛋白酶的添加量越多，水解時間越長，活性肽的分子量越??；具體的分子量比例和范圍與超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶的添加量，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等因素有關(guān)。

20、進一步地，所述目標(biāo)蛋白樣品包括β-乳球蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白、大豆蛋白、菜籽蛋白、花生蛋白、芝麻蛋白、核桃蛋白、亞麻籽蛋白、紫蘇籽蛋白、火麻仁蛋白、杏仁蛋白等動植物蛋白。

21、進一步地，所述目標(biāo)蛋白樣品進行預(yù)處理具體包括：將目標(biāo)蛋白樣品溶解置于恒溫水浴鍋中，在20-100℃處理10-100min，優(yōu)選95℃變性15min，溫度降至室溫后用1m的naoh調(diào)節(jié)ph至9～12；

22、或，所述目標(biāo)蛋白樣品溶解在超純水中(1:10～1：40，w/v)，20-30℃水浴中攪拌1-3h，用1m的naoh調(diào)節(jié)ph至9～12。

23、更進一步地，所述目標(biāo)蛋白樣品溶解溫度為25℃，攪拌時間為1h。

24、進一步地，所述固定化蛋白酶與目標(biāo)蛋白樣品的配比關(guān)系為1mg：1-10mg。

25、進一步地，所述固定化蛋白酶的水解溫度為20-90℃，水解時間為2-30h，優(yōu)選水解溫度30-70℃，水解時間4-24h。

26、進一步地，水解結(jié)束后置于沸水中1-20min，3000-12000×g離心5-20min，收集上清液即得到生物活性肽粗產(chǎn)品。

27、且，所述制備的生物活性肽分子量分布為：<500da為30％-55％，500-1500da為0-40％，1500-3000da為2-45％，3000da以上6-70％；所制備的生物活性肽具有抗氧化特性，abts+自由基清除率為50-70％，fe2+螯合活性為20-90％。

28、綜上所述，本發(fā)明中所述固定化載體為超順磁性氧化石墨烯納米材料，具有較高的比表面積、優(yōu)異的磁性回收、良好的生物相容性等特性；所述超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶是采用亞鐵鹽和鐵鹽改性的磁性氧化石墨烯為載體，通過在載體表面引入羧酸官能團，在edc的作用下促進了羧基和氨基(pega)形成亞胺鍵，實現(xiàn)氧化石墨烯表面的氨基功能化，隨后通過靜電吸附作用實現(xiàn)蛋白酶與磁性氧化石墨烯載體的結(jié)合。以大豆蛋白、芝麻蛋白、亞麻蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白、β-乳球蛋白等作為目標(biāo)蛋白樣品進行預(yù)處理，處理完畢之后加入固定化蛋白酶，在一定條件下進行水解，即得到生物活性肽。本發(fā)明通過引入羧酸官能團來實現(xiàn)磁性氧化石墨烯表面的功能化，構(gòu)建了一種固定蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方法，具有酶活性穩(wěn)定、易回收、可重復(fù)使用以及蛋白水解肽抗氧化性好和分子量范圍可控等優(yōu)點。

29、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果至少包括：

30、(1)本發(fā)明采用亞鐵鹽和鐵鹽改性的磁性氧化石墨烯為載體，通過表面活性劑引入羧酸官能團將載體表面功能化，實現(xiàn)蛋白酶與磁性氧化石墨烯載體共價結(jié)合，制備出一種超順磁性氧化石墨烯納米固定化蛋白酶，顯著提高了蛋白酶的活性和穩(wěn)定性，有效降低了蛋白酶自聚集、自水解的問題。

31、(2)與游離蛋白酶相比，基于超順磁性氧化石墨烯的固定化蛋白酶易于磁性回收，可快速與底物和產(chǎn)品分離，重復(fù)使用7次后，仍能保持50％以上的相對活性，酶活性穩(wěn)定性和重復(fù)使用性效果顯著。

32、(3)基于超順磁性氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶具有廣適性，可用于大豆蛋白、芝麻蛋白、亞麻籽蛋白等油料蛋白和乳清蛋白、牛血清蛋白等不同蛋白來源的高效水解，且水解制備的生物活性肽分子量大小和范圍可控可調(diào)，抗氧化效果較親本蛋白顯著提升，具有較好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力。