本發(fā)明涉及植物提取，尤其涉及一種托盤(pán)根多糖的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、托盤(pán)根中文名為：“懸鉤子”或“牛疊肚”，托盤(pán)根屬于薔薇科植物，作為一種常見(jiàn)的中草藥，廣泛分布于我國(guó)北部、華東及中原地區(qū)；具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，在中國(guó)，它的果實(shí)和根被用作治療各種疾病的民間處方由來(lái)已久。

2、現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，托盤(pán)根的提取物或活性成分具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌、肝保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等；其中的活性天然產(chǎn)物，包括黃酮類(lèi)、類(lèi)固醇、苯丙酸、皂苷類(lèi)和多糖等。

3、現(xiàn)有技術(shù)研究表明，托盤(pán)根中的水溶性成分可能是托盤(pán)根發(fā)揮藥理作用的主要成分，但對(duì)托盤(pán)根中水溶性多糖的研究，特別是多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)解析及生物活性的研究報(bào)道還十分有限；目前有專(zhuān)利和相關(guān)研究也對(duì)托盤(pán)根和同屬植物多糖的純化方法和應(yīng)用進(jìn)行了研究，有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)熱水提取、醇沉淀、脫淀粉、凍融離心、鏈蛋白酶酶解、sevag法脫蛋白、超濾、凝膠柱層析方法純化得水溶性多糖，其純度達(dá)到81.0％，經(jīng)比旋光度測(cè)定、高效液相色譜(hplc)分析證明rcp為均一組分，分子量7000左右；氣相色譜(gc)分析其單糖組成主要為葡萄糖和痕量的鼠李糖，說(shuō)明rcp是一種中性雜多糖。rcp經(jīng)部分酸水解、高碘酸氧化、smith降解、甲基化、gc-ms分析、ir分析、nmr等方法，確定其分子結(jié)構(gòu)為：末端和核心部分都是由glc構(gòu)成，主鏈由1→4glc組成，以1→4,6glc為分支點(diǎn)，平均每9個(gè)1→4glc就有1個(gè)1→4,6分支點(diǎn)。1→6glc和痕量rha可能處于側(cè)鏈中。

4、現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于托盤(pán)根提取的多糖成分純度較低，同時(shí)制備提純方法復(fù)雜，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因此，本發(fā)明提出一種具有肝保護(hù)作用的托盤(pán)根多糖的制備方法和應(yīng)用以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提出一種托盤(pán)根多糖的制備方法和應(yīng)用，該托盤(pán)根多糖的制備方法和應(yīng)用使用水提醇沉法和柱層析方法進(jìn)行托盤(pán)根多糖的提取和純化，操作方法簡(jiǎn)單且穩(wěn)定可靠，提純后的托盤(pán)根多糖純度高，達(dá)到了90％以上，為托盤(pán)根多糖的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)，同時(shí)適于工業(yè)化生產(chǎn)。

2、為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種托盤(pán)根多糖的制備方法，包括以下步驟：

3、步驟一、先將干燥的托盤(pán)根壓碎并過(guò)60目篩得到細(xì)藥材顆粒，然后稱(chēng)取80g細(xì)藥材顆粒裝入2000ml圓底燒瓶中后加入15-30倍體積蒸餾水，在90℃水浴回流2-3h過(guò)濾，重復(fù)操作2-3次，合并濾液并減壓濃縮，向濃縮液中加入3-4倍體積的95％乙醇，醇沉12h后抽濾取上清液，再進(jìn)行旋蒸去除乙醇后冷凍干燥，制得托盤(pán)根粗多糖并稱(chēng)重；

4、步驟二、將托盤(pán)根粗多糖溶解于超純水中，加入sevag試劑除去溶液中的蛋白質(zhì)，得到去除蛋白的多糖水溶液，然后用3000da截流分子量的袋透析三天，去除低分子量組分，最后經(jīng)冷凍干燥得到去除小分子雜質(zhì)的粗多糖；

5、步驟三、將粗多糖配制呈水溶液，先采用deae-52纖維素色譜柱進(jìn)行初步純化，然后使用水和nacl溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，得到初步純化洗脫液，并取樣制得7種多糖；

6、步驟四、將初步純化洗脫液上樣于sephadexg-100柱進(jìn)行下一步純化，以去離子水作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到純化洗脫液，并取樣制得4種純化托盤(pán)根多糖；

7、步驟五、最后使用紫外-可見(jiàn)光分度儀對(duì)純化托盤(pán)根多糖進(jìn)行純度測(cè)定。

8、進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟二中使用的sevag試劑是由氯仿和正丁醇按照4:1的體積比制備得到的；所述步驟三中梯度洗脫時(shí)使用的nacl濃度分別為0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l和1mol/l，梯度洗脫流速為1ml/min。

9、進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟三中得到初步純化洗脫液后收集10ml洗脫液一管，并采用苯酚-硫酸法測(cè)定各組分中多糖含量，然后經(jīng)過(guò)濃縮、透析和冷凍干燥得到7種多糖，分別為d-rcp-1、d-rcp-2、d-rcp-3、d-rcp-4、d-rcp-5、d-rcp-6和d-rcp-7。

10、進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟四中洗脫流速為0.5ml/min，得到純化洗脫液后收集一管5ml的純化洗脫液，測(cè)量吸光度，直到所有多糖全部被收集，采用相同餾分、相同冷凍干燥的方法，得到4種純化托盤(pán)根多糖，分別為rcp-1、rcp-3、rcp-4和rcp-5。

11、進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟五中濃度測(cè)定具體為：

12、s1、取20mg葡萄糖置于100ml容量瓶中加水定容，得到葡萄糖溶液并將其作為對(duì)照品溶液；

13、s2、然后取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml和1.2ml葡萄糖溶液置于試管中，分別加水補(bǔ)至2ml，然后分別加入4％苯酚溶液1ml搖勻，迅速滴加7ml濃h2so4，靜置5min，隨后置于40℃水浴中加熱30min，反應(yīng)至室溫，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，再以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)回執(zhí)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為a＝8.415x+0.1773，r2＝0.9994，其中a表示吸光度，x為葡萄糖質(zhì)量濃度，單位為mg/ml；

14、s3、取純化托盤(pán)根多糖樣品20mg置于25ml容量瓶中加水定容，然后取2ml定容后的溶液于試管中，加入4％苯酚溶液1ml搖勻，迅速滴加7ml的濃h2so4，靜置5min，隨后置于40℃水浴中加熱30min，反應(yīng)至室溫，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，帶入前述線性回歸方程中計(jì)算得出托盤(pán)根多糖濃度。

15、前述的托盤(pán)根多糖的制備方法制得的4種純化托盤(pán)根多糖在肝保護(hù)作用中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明使用水提醇沉法和柱層析方法進(jìn)行托盤(pán)根多糖的提取和純化，操作方法簡(jiǎn)單且穩(wěn)定可靠，提純后的托盤(pán)根多糖純度高，達(dá)到了90％以上，為托盤(pán)根多糖的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)，同時(shí)適于工業(yè)化生產(chǎn)，具有很好的應(yīng)用前景；

17、制備得到的托盤(pán)根多糖含有三螺旋構(gòu)象，具有良好的抗氧化活性，在肝保護(hù)作用藥物和保健品開(kāi)發(fā)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種托盤(pán)根多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種托盤(pán)根多糖的制備方法，其特征在于：所述步驟二中使用的sevag試劑是由氯仿和正丁醇按照4:1的體積比制備得到的；所述步驟三中梯度洗脫時(shí)使用的nacl濃度分別為0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l和1mol/l，梯度洗脫流速為1ml/min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種托盤(pán)根多糖的制備方法，其特征在于：所述步驟三中得到初步純化洗脫液后收集10ml洗脫液一管，并采用苯酚-硫酸法測(cè)定各組分中多糖含量，然后經(jīng)過(guò)濃縮、透析和冷凍干燥得到7種多糖，分別為d-rcp-1、d-rcp-2、d-rcp-3、d-rcp-4、d-rcp-5、d-rcp-6和d-rcp-7。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種托盤(pán)根多糖的制備方法，其特征在于：所述步驟四中洗脫流速為0.5ml/min，得到純化洗脫液后收集一管5ml的純化洗脫液，測(cè)量吸光度，直到多糖組分全部收集，采用相同餾分、相同冷凍干燥的方法，得到4種純化托盤(pán)根多糖，分別為rcp-1、rcp-3、rcp-4和rcp-5。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種托盤(pán)根多糖的制備方法，其特征在于：所述步驟五中濃度測(cè)定具體為

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的托盤(pán)根多糖的制備方法制得的4種純化托盤(pán)根多糖在肝保護(hù)作用中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)一種托盤(pán)根多糖的制備方法，包括步驟一、托盤(pán)根粗多糖的提取，步驟二、粗多糖除蛋白除雜處理，步驟三、初步純化處理，步驟四、進(jìn)一步純化處理制得托盤(pán)根多糖，步驟五、托盤(pán)根多糖的柱層析純化；本發(fā)明使用水提醇沉法和柱層析法進(jìn)行托盤(pán)根多糖提取和純化，操作方法簡(jiǎn)單且穩(wěn)定可靠，提純后的托盤(pán)根多糖純度高，達(dá)到了90％以上，為托盤(pán)根多糖的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)，同時(shí)適于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：楊秀東,劉新月,白子凡,陳慧凌,簡(jiǎn)麗樵,李沐淳,楊艷俊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：吉林化工學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8