本發(fā)明屬于微藻油脂生物合成，更具體地，涉及一種使用甘露糖誘導(dǎo)提高微藻油脂積累的方法。

背景技術(shù)：

1、由于化石燃料資源有限、不可再生且會(huì)造成環(huán)境污染，探索環(huán)保且可再生的能源路徑已成為全球性的重要議題。在眾多可再生能源中，生物質(zhì)能源，如生物燃料，以其原材料資源豐富、生產(chǎn)過程清潔低碳的特點(diǎn)，贏得了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。微藻作為一種第三代生物燃料的潛在來源，因其快速的生長速度、高油脂含量、空間需求小且靈活和能利用廢水廢氣生長等顯著優(yōu)勢而備受關(guān)注。盡管使用微藻生產(chǎn)生物燃料具有廣闊的前景，但其商業(yè)化應(yīng)用仍面臨培養(yǎng)成本高、生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率較低的限制。為了提高微藻的油脂產(chǎn)率，研究者們主要通過高光、高鹽、氮磷營養(yǎng)元素限制等非生物脅迫條件或添加誘導(dǎo)劑來實(shí)現(xiàn)。這些方法雖然在一定程度上有效，但存在一些問題，如氮饑餓策略雖然可以促進(jìn)油脂積累，但應(yīng)用期間需要精確控制培養(yǎng)條件，包括氮源的添加和去除，這增加了操作復(fù)雜性和成本。因此，尋找更多便于操作的提高微藻的油脂產(chǎn)率的誘導(dǎo)調(diào)控手段，對于微藻產(chǎn)油的生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)步、促進(jìn)商業(yè)化開發(fā)利用具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明的目的在于提供一種使用甘露糖誘導(dǎo)提高微藻油脂積累的方法，首次揭示了甘露糖應(yīng)用于微藻培養(yǎng)時(shí)能夠提高微藻油脂積累，通過使用甘露糖的濃度不低于0.5g/l，能夠簡單、靈活、快速的誘導(dǎo)提高不同環(huán)境條件(如，不同初始細(xì)胞密度、添加不同碳源和添加不同濃度氮源)和生長狀態(tài)(如，自養(yǎng)或混養(yǎng)不同生長時(shí)期)下的微藻的油脂含量。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了甘露糖在培養(yǎng)微藻以提高微藻油脂積累中的應(yīng)用，其特征在于，所述甘露糖在培養(yǎng)基中的濃度不低于0.5g/l。

3、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述培養(yǎng)為自養(yǎng)培養(yǎng)、異養(yǎng)培養(yǎng)或者混養(yǎng)培養(yǎng)。

4、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述微藻為索羅金小球藻、小球藻屬微藻、雨生紅球藻。

5、按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種使用甘露糖誘導(dǎo)提高微藻油脂積累的方法，其特征在于，所述方法是將微藻種子液接種至含甘露糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)油脂積累培養(yǎng)；所述含甘露糖的培養(yǎng)基中，甘露糖的濃度不低于0.5g/l；

6、或者，所述方法是先將微藻種子液接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再在培養(yǎng)過程中向所述培養(yǎng)基中加入甘露糖繼續(xù)培養(yǎng)，從而利用甘露糖提高微藻油脂積累；所述甘露糖的加入量滿足使培養(yǎng)基中甘露糖的濃度不低于0.5g/l。

7、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，當(dāng)所述方法是將微藻種子液接種至含甘露糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)油脂積累培養(yǎng)時(shí)：

8、所述含甘露糖的培養(yǎng)基中甘露糖的濃度為0.5-8g/l；

9、優(yōu)選的，所述含甘露糖的培養(yǎng)基為改良后的bg11培養(yǎng)基，是通過向原始bg11培養(yǎng)基中加入甘露糖，并可選的加入葡萄糖和硝酸鈉改良得到的；所述含甘露糖的培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為0-5g/l，硝酸鈉的濃度為0-3g/l；

10、所述培養(yǎng)滿足：培養(yǎng)溫度為28℃，光暗周期為12/12h，光照強(qiáng)度為70μmol?m-2s-1，培養(yǎng)時(shí)間為1-10day，培養(yǎng)氣氛為空氣，流速為0.2-0.7l/min。

11、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，當(dāng)所述方法是將微藻種子液接種至含甘露糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)油脂積累培養(yǎng)時(shí)：

12、所述含甘露糖的培養(yǎng)基中甘露糖的濃度為0.5-8g/l；

13、所述含甘露糖的培養(yǎng)基為改良后的bg11培養(yǎng)基，是通過向原始bg11培養(yǎng)基中加入甘露糖改良得到的；

14、所述培養(yǎng)滿足：培養(yǎng)溫度為28℃，光暗周期為12/12h，光照強(qiáng)度為70μmol?m-2s-1，培養(yǎng)時(shí)間為1-10day，培養(yǎng)氣氛為5vol％co2濃度的壓縮空氣，流速為0.2-0.7l/min。

15、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，當(dāng)所述方法是先將微藻種子液接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再在培養(yǎng)過程中向所述培養(yǎng)基中加入甘露糖繼續(xù)培養(yǎng)，從而利用甘露糖提高微藻油脂積累時(shí)：

16、所述甘露糖的加入量滿足使培養(yǎng)基中甘露糖的濃度為0.5-8g/l；

17、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基為改良后的bg11培養(yǎng)基，是通過向原始bg11培養(yǎng)基中可選的加入葡萄糖和硝酸鈉改良得到的；所述培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為0-5g/l，硝酸鈉的濃度為0-3g/l；

18、更優(yōu)選的，加入甘露糖之前的培養(yǎng)以及加入甘露糖之后的培養(yǎng)均滿足：培養(yǎng)溫度為28℃，光暗周期為12/12h，光照強(qiáng)度為70μmol?m-2s-1；加入甘露糖之后的培養(yǎng)時(shí)間為1-10day。

19、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述微藻種子液是通過將微藻接種至預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)后離心濃縮得到的；

20、優(yōu)選的，所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為改良后的bg11培養(yǎng)基，是通過向原始bg11培養(yǎng)基中添加葡萄糖和酵母提取物改良得到的；所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，葡萄糖的濃度為5g/l，酵母提取物的濃度為2g/l；

21、所述預(yù)培養(yǎng)滿足：培養(yǎng)溫度為28℃，光暗周期為12/12h，光照強(qiáng)度為70μmol?m-2s-1，培養(yǎng)時(shí)間為3-4day。

22、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述微藻為索羅金小球藻、小球藻屬微藻、雨生紅球藻；所述微藻種子液接種后滿足最終od680＝0.1-4。

23、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述方法還包括：在培養(yǎng)完成后收集藻細(xì)胞，冷凍干燥后使用有機(jī)溶劑提取藻細(xì)胞中的油脂；優(yōu)選的，所述收集具體是使用離心收集；收集后，先用蒸餾水洗滌2-3次，再置于-80℃冷凍12h，隨后真空冷凍干燥48h，收集凍干粉末；所述有機(jī)溶劑為氯仿與甲醇按體積比1:1混合得到的氯仿-甲醇混合溶液；

24、更優(yōu)選的，所述方法還包括：培養(yǎng)完成收集藻細(xì)胞后，通過向剩余培養(yǎng)基中添加損失的無機(jī)鹽和碳氮源后，能夠重新接種微藻種子液用于新一輪的誘導(dǎo)油脂積累培養(yǎng)。

25、通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次揭示了甘露糖應(yīng)用于微藻培養(yǎng)時(shí)能夠提高微藻油脂積累(當(dāng)然，甘露糖在培養(yǎng)基中的濃度需要不低于0.5g/l)；以后文實(shí)施例為例，采用本發(fā)明方法的微藻的油脂含量增加。本發(fā)明培養(yǎng)方法簡便且易于操作，能在短時(shí)間內(nèi)靈活快速持久的顯著提高不同環(huán)境條件(如，不同初始細(xì)胞密度、添加不同碳源和添加不同濃度氮源)和生長狀態(tài)(如，自養(yǎng)或混養(yǎng)不同生長時(shí)期)下的微藻脂質(zhì)含量，降低微藻養(yǎng)殖成本，最大程度地實(shí)現(xiàn)微藻生物柴油經(jīng)濟(jì)性的潛在高效的生產(chǎn)途徑。

26、具體說來，本發(fā)明具有如下的有益效果：

27、(1)甘露糖作為一種非營養(yǎng)限制型誘導(dǎo)劑，能夠在不依賴氮饑餓等傳統(tǒng)方法的情況下，顯著提高微藻的油脂含量，使微藻油脂含量與添加甘露糖前相比最高提升1.82倍(如后文實(shí)施例5與對比例5所對比展示的，兩者的硝酸鈉添加量均為1.5g/l)，油脂含量最高可超過40％(如后文實(shí)施例15所展示的)；

28、當(dāng)然，本發(fā)明中甘露糖這一提高微藻油脂積累策略也可以配合氮饑餓操作，以后文實(shí)施例為例，在同樣的氮饑餓條件下，相對于對比例14，實(shí)施例12在甘露糖誘導(dǎo)下獲得更高油脂含量(對比例14對應(yīng)傳統(tǒng)提升微藻油脂含量的氮饑餓操作，實(shí)施例12為在氮饑餓的基礎(chǔ)上添加甘露糖誘導(dǎo))；

29、(2)甘露糖誘導(dǎo)效果迅速、靈活且持續(xù)，在微藻自養(yǎng)或混養(yǎng)培養(yǎng)的不同生長階段下，在微藻異養(yǎng)培養(yǎng)下，或不同初始細(xì)胞密度下，甘露糖的添加均能在短期內(nèi)快速誘導(dǎo)促進(jìn)微藻油脂積累；

30、(3)添加額外的碳源，可以在甘露糖誘導(dǎo)促進(jìn)微藻油脂含量提升時(shí)，同步提高微藻的生物量；

31、(4)甘露糖作為含量豐富的可再生資源木質(zhì)纖維素的組分之一，廣泛存在于工農(nóng)業(yè)廢棄物、生物精煉廢水以及多種天然植物和微生物中，便于獲得，具有廣泛的應(yīng)用潛力。此外，本發(fā)明方法中甘露糖在培養(yǎng)期間沒有被顯著消耗，可以在培養(yǎng)完成收集藻細(xì)胞后，通過向剩余培養(yǎng)基中添加損失的無機(jī)鹽和碳氮源后，能夠重新接種微藻種子液用于新一輪的誘導(dǎo)油脂積累培養(yǎng)。

32、(5)甘露糖誘導(dǎo)有助于克服傳統(tǒng)方法的局限性，提高微藻油脂含量，為微藻生物燃料的商業(yè)化應(yīng)用提供了新的技術(shù)途徑。