本發(fā)明涉及生物，特別是涉及用于虎源貓杯狀病毒的熒光定量pcr引物組和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、貓杯狀病毒（feline?calicivirus,?fcv）是一種廣泛存在于貓科動(dòng)物中的病毒，可引起貓科動(dòng)物的多種疾病，包括貓鼻氣管炎、貓杯狀病毒病等。fcv屬于小核糖核酸病毒目（picornavirales）中的一個(gè)病毒科，該病毒的基因組由一個(gè)單股正鏈不分節(jié)段的rna分子構(gòu)成，其中包含三個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框（open?reading?frames，orfs）：orf1編碼的多聚蛋白被裂解為多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，包括解旋酶、蛋白酶和聚合酶等；orf2被加工成前導(dǎo)衣殼蛋白（leader?of?the?capsid，lc）和成熟衣殼蛋白（vp1）；orf3編碼一個(gè)基因組高度保守的小結(jié)構(gòu)蛋白vp2，在病毒的復(fù)制或組裝中起重要作用。近年有研究者報(bào)道在一些正鏈rna病毒的負(fù)鏈，如冠狀病毒，也存在一些小的orf，編碼具有功能性的小病毒蛋白，然而目前在杯狀病毒科還未有報(bào)道。杯狀病毒科共有11個(gè)屬，能夠感染多種脊椎動(dòng)物，其中7個(gè)屬主要感染哺乳動(dòng)物，包括vesivirus（水皰性病毒屬）、sapovirus（札幌病毒屬）、nebovirus（紐布病毒屬）、norovirus（諾如病毒屬）、lagovirus（兔出血癥病毒屬）、recovirus和valovirus；2個(gè)屬主要感染禽類，包括bavovirus和nacovirus；還有2個(gè)屬感染魚(yú)類，即minovirus和salovirus。fcv為其中的水泡性病毒屬。

2、在前期研究中，對(duì)一例生前具有臨床癥狀的虎的組織樣品進(jìn)行宏病毒組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)一株虎源fcv（tfcv），通過(guò)病毒分離、電鏡觀察、pcr鑒定確定該株杯狀病毒可能是導(dǎo)致該虎死亡的主要病毒病原，命名為lyh1224，經(jīng)檢測(cè)該新型虎源貓杯狀病毒與目前已知的fcv毒株相似性不高，遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，已公開(kāi)的對(duì)于已知fcv毒株的引物組或檢測(cè)方法對(duì)該新型虎源貓杯狀病毒毒株無(wú)法進(jìn)行有效檢測(cè)，缺乏對(duì)該新型毒株的快速檢測(cè)技術(shù)，無(wú)法滿足新型fcv病原的動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)、防控的需求，更缺乏特異性檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于虎源貓杯狀病毒的熒光pcr引物組，該引物組能夠針對(duì)新型虎源貓杯狀病毒毒株lyh1224進(jìn)行有效檢測(cè)，且相對(duì)于傳統(tǒng)pcr具有更高的靈敏性，相對(duì)于lamp和rpa等其他核酸檢測(cè)方法具有更高的特異性和性價(jià)比。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于虎源貓杯狀病毒的熒光定量pcr引物組，該虎源貓杯狀病毒的序列如seq?id?no：1所示；該熒光定量pcr引物組包括：

3、上游引物：attgtcatctatgtaagggagtc（seq?id?no：4）；

4、下游引物：tggaagccaaagccgta（seq?id?no：5）。

5、對(duì)上述新型虎源貓杯狀病毒進(jìn)行blast分析，顯示lyh1224全基因組與目前已知的fcv最高相似性僅有85.14%（圖1），相似度最高的已知fcv毒株為2013年從貓鼻咽拭子分離獲得的fcv毒株fb-nj-13（圖1中由上至下第1行）；通過(guò)與ncbi相似性最高的前100株毒株遺傳進(jìn)化分析（圖2），表明lyh1224（圖2中的query_1234111）毒株與現(xiàn)有的fcv遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，且位于進(jìn)化樹(shù)的外圍。不高的相似性、較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系導(dǎo)致已公開(kāi)的對(duì)于已知fcv毒株的引物組或檢測(cè)方法對(duì)該新型虎源貓杯狀病毒毒株無(wú)法進(jìn)行有效檢測(cè)，且對(duì)于該新型虎源貓杯狀病毒lyh1224毒株的檢測(cè)，還需要兼顧與其他貓杯狀病毒的有效區(qū)分，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。因此，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)找到該新型虎源貓杯狀病毒lyh1224毒株相對(duì)其他fcv基因組具有特異性的靶基因序列區(qū)域，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步設(shè)計(jì)得到上述熒光pcr引物組。

6、同時(shí)考慮到虎類這種大型貓科動(dòng)物取樣的操作難度、貓杯狀病毒毒株感染后病程的進(jìn)展速度，雖然目前對(duì)于fcv的檢測(cè)方法多樣，包括傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)方法等，但這些方法在靈敏度、特異性和操作便捷性方面存在一定的局限性。因此，以qpcr技術(shù)為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)對(duì)fcv核酸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的定量分析。上述熒光pcr引物組，結(jié)合qpcr技術(shù)的高靈敏度、高特異性、快速和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)新型虎源貓杯狀病毒lyh1224毒株實(shí)現(xiàn)了較高靈敏度、特異性的檢測(cè)。

7、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光定量pcr引物組的擴(kuò)增片段序列如seq?id?no：2所示。

8、本發(fā)明還提供了所述的熒光定量pcr引物組在制備用于檢測(cè)虎源貓杯狀病毒的試劑和/或試劑盒中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)虎源貓杯狀病毒的試劑盒，包括所述的熒光定量pcr引物組。

10、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒包括熒光定量pcr反應(yīng)體系，所述熒光定量pcr反應(yīng)體系包括所述的熒光定量pcr引物組。

11、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光定量pcr引物組的工作濃度為0.3-0.7μm。

12、本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的虎源貓杯狀病毒的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括以下步驟：提取待測(cè)樣本的核酸，反轉(zhuǎn)錄得到cdna，采用所述的試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)。

13、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述虎源貓杯狀病毒的序列如seq?id?no：1所示。

14、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光定量pcr反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性30?s；95℃變性5?s，60℃退火延伸45?s，40個(gè)循環(huán)。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

16、本發(fā)明的用于虎源貓杯狀病毒的熒光定量pcr引物組和應(yīng)用，該熒光定量pcr引物組能夠針對(duì)新型虎源貓杯狀病毒毒株lyh1224進(jìn)行有效檢測(cè)，且相對(duì)于傳統(tǒng)pcr具有更高的靈敏性，相對(duì)于lamp和rpa等其他核酸檢測(cè)方法具有更高的特異性和性價(jià)比。該熒光定量pcr引物組和熒光定量pcr技術(shù)結(jié)合，能夠滿足野生動(dòng)物，特別是大型野生貓科動(dòng)物的疫病監(jiān)測(cè)、防控的需求，填補(bǔ)了目前針對(duì)該臨床新型虎源fcv（lyh1224毒株）熒光定量檢測(cè)方法空白，具有較好的應(yīng)用前景，不僅在技術(shù)上具有創(chuàng)新性，而且在實(shí)際應(yīng)用中具有重要的臨床和科研價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.?一種用于虎源貓杯狀病毒的熒光定量pcr引物組，其特征在于，該虎源貓杯狀病毒的序列如seq?id?no：1所示；該熒光定量pcr引物組包括：上游引物：attgtcatctatgtaagggagtc（seq?id?no：4）；下游引物：tggaagccaaagccgta（seq?id?no：5）。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量pcr引物組，其特征在于，所述熒光定量pcr引物組的擴(kuò)增片段序列如seq?id?no：2所示。

3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的熒光定量pcr引物組在制備用于檢測(cè)虎源貓杯狀病毒的試劑盒中的應(yīng)用。

4.一種用于檢測(cè)虎源貓杯狀病毒的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的熒光定量pcr引物組。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括熒光定量pcr反應(yīng)體系，所述熒光定量pcr反應(yīng)體系包括權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的熒光定量pcr引物組。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量pcr引物組的工作濃度為0.3-0.7μm。

7.一種非診斷目的的虎源貓杯狀病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，該檢測(cè)方法包括以下步驟：提取待測(cè)樣本的核酸，反轉(zhuǎn)錄得到cdna，采用權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)。

8.?根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，所述虎源貓杯狀病毒的序列如seq?id?no：1所示。

9.?根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光定量pcr反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性30?s；95℃變性5?s，60℃退火延伸45?s，40個(gè)循環(huán)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種用于虎源貓杯狀病毒的熒光定量PCR引物組和應(yīng)用，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。該虎源貓杯狀病毒的序列如SEQ?ID?NO：1所示；該熒光定量PCR引物組包括：上游引物：ATTGTCATCTATGTAAGGGAGTC；下游引物：TGGAAGCCAAAGCCGTA。該引物組能夠針對(duì)新型虎源貓杯狀病毒毒株LYH1224進(jìn)行有效檢測(cè)，且相對(duì)于傳統(tǒng)PCR具有更高的靈敏性，相對(duì)于LAMP和RPA等其他核酸檢測(cè)方法具有更高的特異性和性價(jià)比。

技術(shù)研發(fā)人員：周妞,陳武,沈永義,劉兆陽(yáng),劉敏婷,單芬,吳亞江
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州動(dòng)物園（掛廣州市野生動(dòng)物研究中心牌子）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8