本發(fā)明屬于細胞工程，特別是涉及一種家犬誘導多能干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的方法。

背景技術：

1、神經(jīng)系統(tǒng)疾病是影響人類健康的主要疾病之一，包括帕金森、腦腫瘤、腦癱等多種類型，尤其是大量神經(jīng)元死亡導致神經(jīng)功能損傷的疾病如腦卒中、阿茲海默癥等，這類損傷很難再修復或再生，對患者及家庭帶來極大的傷害。神經(jīng)干細胞是一種存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的專能干細胞，在特定條件下，具備良好的自我更新潛力和分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞等高度分化細胞的能力。研究表明神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)均在腦功能的調(diào)節(jié)中起著重要作用。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)結構和功能的基本單位，它們傳送并接收電沖脈和神經(jīng)化學信號來處理信息。少突膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生髓磷脂，能為軸突提供保護鞘，并提升神經(jīng)元間電信號的傳導速度。星形膠質(zhì)細胞通過支持血腦屏障內(nèi)皮細胞的功能，并在為神經(jīng)元提供營養(yǎng)以及合成某些神經(jīng)遞質(zhì)中起到重要作用?；谏窠?jīng)干細胞的再生和專向分化潛力，神經(jīng)干細胞移植可有望成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想細胞。誘導多能干細胞可直接從患者皮膚獲取，解決了無法從患者腦區(qū)獲取神經(jīng)干細胞的難題。由誘導能多干細胞衍生的神經(jīng)干細胞將與患者基因匹配，消除了免疫排斥的可能性。

2、家犬作為人類的忠實伙伴，經(jīng)常遭受各種神經(jīng)疾病的困擾，如退行性關節(jié)疾病導致的神經(jīng)壓迫、無菌性股骨壞死引發(fā)的神經(jīng)損傷等。這些疾病往往傳統(tǒng)治療方法效果有限，給寵物帶來極大的痛苦，也影響了它們與主人的生活質(zhì)量。神經(jīng)干細胞具有自我更新和多向分化的能力，能夠在特定條件下分化為神經(jīng)細胞，從而修復或替換受損的神經(jīng)細胞，改善寵物的神經(jīng)功能，減輕癥狀。但是從動物活體中獲取神經(jīng)干細胞存在倫理問題，限制了這種方法的應用范圍和頻率，同時，這種方法獲得的神經(jīng)干細胞的質(zhì)量和數(shù)量可能受到動物個體差異和環(huán)境因素的影響，可能會影響實驗結果的一致性和可靠性。誘導多能干細胞(ipsc)已廣泛應用于人類生殖醫(yī)學研究。隨著先進醫(yī)療護理對狗和貓的重要性日益增加，人們也期望能夠為這些伴侶動物開發(fā)出ipsc新療法。通過研究家犬誘導多能干細胞分化為神經(jīng)細胞，還可以進一步推動干細胞技術在獸醫(yī)科學領域的發(fā)展，為更多寵物的疾病治療提供新的希望。同時，這一研究也有助于人類更好地理解神經(jīng)細胞的分化機制和相關疾病的發(fā)病機理，為人類的神經(jīng)科學研究提供有益的參考。研究家犬誘導多能干細胞分化為神經(jīng)細胞具有重要的科學意義和實際應用價值。

3、經(jīng)檢索，現(xiàn)有技術多以小鼠、大鼠或人源誘導多能干細胞來獲取誘導神經(jīng)細胞，還沒有將家犬誘導多能干細胞成功分化為神經(jīng)細胞(神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞)的相關報道。家犬誘導多能干細胞(ipscs)分化為神經(jīng)細胞的研究在技術上和生物學上面臨多重挑戰(zhàn)，這些問題主要源于物種特異性差異、分化效率、分化穩(wěn)定性等。家犬的生物學特性(如細胞代謝速率、分化通路敏感性、基因表達譜)可能與人類或嚙齒類存在顯著差異，神經(jīng)細胞類型多且復雜，而對于家犬的神經(jīng)譜系分化研究尚不充分，將家犬誘導多能干細胞成功分化成神經(jīng)細胞，并且避免其他不良分化在技術上仍有挑戰(zhàn)，還需要特定的培養(yǎng)液成分與生長因子的結合來優(yōu)化體外家犬誘導神經(jīng)細胞的培養(yǎng)及擴增。因此，家犬誘導多能干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細胞的研究仍需進一步摸索，以此得到一種能成功將誘導多能干細胞(ipscs)分化為神經(jīng)細胞的培養(yǎng)體系。

技術實現(xiàn)思路

1、基于以上技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種家犬誘導多能干細胞向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化的方法，誘導的神經(jīng)前體細胞具備向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞分化的能力。

2、本發(fā)明的技術方案如下

3、一種家犬誘導多能干細胞向神經(jīng)細胞分化的方法，包括以下步驟：

4、s1家犬誘導多能干細胞向神經(jīng)前體細胞分化

5、s11家犬誘導多能干細胞復蘇：從液氮中取出凍存的家犬誘導多能干細胞，37℃水浴快速解凍后100rpm離心3min，去除冷凍劑，mtesr多能干細胞完全培養(yǎng)液重懸，于低吸附培養(yǎng)板中在37度5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，

6、s12分化第一階段：

7、將s11復蘇培養(yǎng)的家犬誘導多能干細胞以5*104布板至laminin和多聚鳥氨酸聯(lián)合包被后的12孔板中，24小時細胞貼壁后換成神經(jīng)前體細胞誘導液1，每隔24小時更換誘導液，連續(xù)誘導1-7天；所述的神經(jīng)前體細胞誘導液1為2％50×b27、0.5-1μm?y27632、dmem/f12培養(yǎng)基；

8、s13分化第二階段：

9、誘導1-7天后，將神經(jīng)前體細胞誘導液1更換成神經(jīng)前體細胞誘導液2，每隔24小時更換誘導液，連續(xù)誘導7-21天，得到神經(jīng)前體細胞；所述的神經(jīng)前體細胞誘導液2：2％50×b27、10-25ng/ml?egf、10-25ng/ml?fgf、2-5ug/ml?heparin、dmem/f12培養(yǎng)基；

10、s2神經(jīng)前體細胞分化培養(yǎng)成將神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞

11、將s1中獲得的神經(jīng)前體細胞以5*104布板至laminin包被后的12孔板中，以神經(jīng)元誘導分化液、少突膠質(zhì)細胞誘導分化液、星形膠質(zhì)細胞誘導分化液誘導神經(jīng)前體細胞分別向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞分化培養(yǎng)，每隔24小時更換誘導液，連續(xù)誘導27天。

12、優(yōu)選地，s2步驟中所述的神經(jīng)元誘導分化液為2％50×b27、1％100×n2、10-25ng/mlbdnf、10-25ng/ml?gdnf、dmem/f12培養(yǎng)基；所述的少突膠質(zhì)細胞誘導分化液為2％50×b27、1％100×n2、10-25ng/mlpdnf、dmem/f12培養(yǎng)基；所述的星形膠質(zhì)細胞誘導分化液為1％100×n2、1-2％fbs、10-25ng/ml?egf、10-25ng/mlfgf、10-25ng/ml?cntf、dmem/f12培養(yǎng)基。

13、優(yōu)選地，s2步驟中所述的神經(jīng)元誘導分化液成分如下：2％50×b27、1％100×n2、20ng/ml?bdnf、20ng/ml?gdnf；少突膠質(zhì)細胞誘導分化液成分如下2％50×b27、1％100×n2、20ng/mlpdnf、dmem/f12培養(yǎng)基；星形膠質(zhì)細胞誘導分化液成分如下：1％100×n2、2％fbs、20ng/ml?egf、20ng/mlfgf、20ng/ml?cntf、dmem/f12培養(yǎng)基。

14、優(yōu)選地，s1步驟中所述的神經(jīng)前體細胞誘導液1為：2％50×b27、0.5μmy27632、dmem/f12培養(yǎng)基；神經(jīng)干細胞誘導液2為：2％50×b27、20ng/ml?egf、20ng/ml?fgf、2ug/mlheparin、dmem/f12培養(yǎng)基。

15、優(yōu)選地，s1步驟所述的mtesr多能干細胞完全培養(yǎng)液的成分為39.84ml?mtesrtm?1基礎培養(yǎng)基+10ml?5×supplement+10ng/mlfgf+10ng/ml?hlif+0.3μm?pifithrin-μ+0.5μma83-01+0.5μm?y27632+0.5μm?pd0325901+3μm?chir99021+250μm?sodium?butyrate。

16、進一步地，所述的laminin的工作濃度為10-20ng/ml；多聚鳥氨酸的工作濃度為20ng/ml。

17、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

18、1.本發(fā)明首次成功將家犬誘導多能干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞。本發(fā)明利用家犬誘導多能干細胞來獲取神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞，解決了現(xiàn)有技術中需要從動物活體中獲取神經(jīng)細胞的方式，避免了倫理問題的產(chǎn)生，也能減少實驗動物的使用，一定程度上減少了實驗成本。

19、2.本發(fā)明的誘導方案簡單，先從家犬誘導多能干細胞誘導為神經(jīng)前體細胞，誘導的神經(jīng)前體細胞具備向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞分化的能力，為神經(jīng)細胞的制備提供一種高效、可靠的途徑，這也為研究神經(jīng)細胞的功能和相互作用提供了便利。本發(fā)明的神經(jīng)前體細胞的質(zhì)量和數(shù)量更為穩(wěn)定，受動物個體差異和環(huán)境因素的影響較小，從而提高了實驗結果的一致性和可靠性。

20、3.本發(fā)明的神經(jīng)前體細胞誘導方法操作簡便，具有廣泛的應用前景。